以p16/Ki-67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法技术

本发明专利技术属于体外诊断医疗器械技术领域，具体公开了一种以p16/Ki

【技术实现步骤摘要】
以p16/Ki
‑
67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法


[0001]本专利技术属于体外诊断医疗器械
，尤其涉及一种以p16/Ki
‑
67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法。

技术介绍

[0002]近年来，中国宫颈癌发病和死亡负担严重，且呈上升趋势，宫颈癌筛选被认为是降低宫颈癌发病率和死亡率最有效措施。宫颈癌的发病与人乳头瘤病毒(HPVs)密切相关，HPVs是一种小型双链DNA病毒，特异性感染上皮细胞，HPV家族包含约200多种病毒亚型，每种病毒亚型的组织特异性不同，大多数HPV亚型引起的病变为良性，只有少部分HPV亚型为高危亚型，可引起肿瘤。
[0003]宫颈癌及癌前病变筛查包括三个阶段，分别为子宫颈细胞学筛查(初诊)、阴道镜检(转诊)和子宫颈活检组织病理学(确诊)。
[0004]其中，子宫颈细胞学筛查需遵循以下两项基本原则：即尽可能减少高级别病变及以上(HSIL,高度的鳞状上皮内病变(CINII
+
))的漏筛和漏检(随访复查和常规筛查)的同时，亦尽可能减少低级别病变及以下(LSIL，鳞状上皮低密度病变(CINI
‑
))的过度筛查。
[0005]子宫颈细胞学筛查经历了三个以下阶段的演变：
[0006]阶段一、
①
采用巴氏涂片法(CPS)进行初诊，具体是在宫颈移行带取材、涂片和巴氏染色，在显微镜下观察细胞形态学改变的一种方法，其诊断标准分为五级：巴氏Ⅰ级
‑
正常、巴氏Ⅱ级
‑
炎症。巴氏Ⅲ级
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可疑癌；巴氏Ⅳ级
‑
高度可疑癌；巴氏
Ⅴ
级
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癌。这种诊断方法虽然便宜，便于普查，但是由于细胞堆积在一起，不便于观察，准确率低。
②
LBC(液基细胞学检测)：用特制的小毛刷沿宫颈表面和宫颈管刷几圈，收集到的细胞经计算处理称为单层排列的细胞，诊断准确率高，对设备和技术的要求较高，价格偏贵。诊断标准大致分为：感染、反应性改变、上皮细胞异常(如不典型鳞状上皮细胞、低度或鳞状上皮内病变、鳞状细胞癌、不典型腺细胞、宫颈腺癌等)。
[0007]阶段二、病因生物标记物；
[0008](1)检测核酸，包括HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA；(2)检测蛋白，包括HPV L1壳蛋白和HPV E6/E7蛋白。HPV的晚期基因区(L)位于HPV DNA序列的下游，含有两个开放阅读框架，其中HPV L1编码的HPV L1壳蛋白是HPV的主要衣壳蛋白。
[0009]阶段三、病变生物标记物；
[0010](1)检测核酸：包括DNA倍体、人类染色体末端酶RNA基因(hTERC)和DNA甲基化。(2)检测蛋白：包括以p16、Ki
‑
67、TOP2A、MCM2为靶标的免疫细胞化学染色法(Immunocytochemistry，ICC)。
[0011]p16基因又名多肿瘤抑癌基因(multiple tumor suppressor 1，MTS)，其在细胞核和细胞浆中表达的抑癌蛋白p16是细胞周期进展负调节蛋白。当人乳头瘤病毒整合感染宫颈上皮细胞后，引入并激活致癌基因E7，促使致癌蛋白E7表达，抑制pRB蛋白(由抑癌基因Rb
编码得到)与E2F蛋白结合，促进宫颈上皮细胞增殖。当细胞增殖过度，将激活细胞增殖负反馈调节机制，即通过激活抑癌基因p16，促使抑癌蛋白p16表达，促进pRB与E2F蛋白结合，从而抑制宫颈上皮细胞过度增殖。
[0012]Ki
‑
67基因是与细胞增殖相关的基因，其表达因细胞周期时相不同而异，开始表达于细胞周期的G1期，在S期及G2期表达增加，至M期表达达高峰，在细胞有丝分裂后期迅速降解或失去抗原决定簇，G0期不表达。由于其半衰期短，不易受生长因子诱导，可作为评价细胞生长分数的指标。在同一个细胞周期，生理机能正常细胞极少同时表达p16(细胞增殖负向调节蛋白)和Ki
‑
67蛋白(细胞增殖指标)，如二者同时表达，则提示细胞周期失调。
[0013]微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance protein，MCM)是真核生物DNA复制的主要调控因子之一，MCM2蛋白存在于细胞核，其家族成员MCM2被认为是特异性增殖相关因子。MCM2为细胞周期S期异常的分子标记物，当人乳头瘤病毒整合感染宫颈上皮细胞后，引入并激活致癌基因E6和E7，促使致癌蛋白E6和E7表达，致使宫颈上皮细胞G1期向S期过渡受限。
[0014]TOP2A(topoisomerase(DNA)II alpha)基因是细胞周期异常标志物，可单独/联合用于子宫颈及癌前病变筛查。DNA拓扑异构酶，可改变DNA拓扑状态，细胞异常增殖因子，新型肿瘤预后判定指标。
[0015]现有免疫细胞化学单染色检测，仅检测细胞是否产生阳性染色，检测不全面。有的判读方法以多个靶标检测后，出现两个以上阳性细胞，作为阳性。会产生大量的假阳性，或漏诊的现象，失去了辅助诊断的意义。有的判定方法过于草率，如多个靶标中，只要出现两个以上靶标染色显示阳性，则判定为高风险，会造成大量的过度筛查。故有必要对于多染的细胞免疫化学染色的判读方法，进一步的规范和确认。

技术实现思路

[0016]本专利技术的目的在于提供一种以p16/Ki
‑
67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒及其判读方法，以至少解决上述技术问题之一。
[0017]本专利技术目的之一在于提供：以p16/Ki
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67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，包括试剂：p16/Ki
‑
67一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、TOP2A/MCM2一抗工作混合液、DAB工作混合液、RED工作混合液和苏木素。
[0018]优选地，p16/Ki
‑
67一抗工作混合液包括抗体稀释液、p16一抗浓缩液和Ki
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67一抗浓缩液；TOP2A/MCM2一抗工作混合液包括抗体稀释液、TOP2A一抗浓缩液和MCM2一抗浓缩液；DAB工作混合液包括DAB染色底物、DAB染色缓冲液；RED工作混合液包括AP
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red显色缓冲液、AP
‑
red色原浓缩液。
[0019]本专利技术目的之二在于提供：上述宫颈癌检测试剂盒的判读方法，宫颈细胞采样后制备两张子宫颈脱落细胞制片，分别为细胞制片1和细胞制片2；
[0020]采用p16/Ki
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67一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、苏木素对细胞制片1进行p16/Ki
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67免疫组织化学染色；
[0021]采用TOP2A/MCM2一抗工作混合液、RED工作混合液、羊抗兔二抗工作液、苏木素对细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.以p16/Ki
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67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，其特征在于，包括试剂：p16/Ki
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67一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、TOP2A/MCM2一抗工作液、DAB工作混合液、RED工作混合液和苏木素。2.根据权利要求1所述的以p16/Ki
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67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒，其特征在于，p16/Ki
‑
67一抗工作混合液包括抗体稀释液、p16一抗浓缩液和Ki
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67一抗浓缩液；TOP2A/MCM2一抗工作液包括抗体稀释液、TOP2A一抗浓缩液和MCM2一抗浓缩液；羊抗鼠/兔二抗工作混合液包括羊抗鼠二抗工作液和羊抗兔二抗工作液；DAB工作混合液包括DAB染色底物、DAB染色缓冲液；RED工作混合液包括AP
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red显色缓冲液、AP
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red色原浓缩液。3.根据权利要求1或2所述的以p16/Ki
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67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒的判读方法，其特征在于，制备两张子宫颈脱落细胞制片，分别为细胞制片1和细胞制片2。采用p16/Ki
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67一抗工作混合液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、DAB工作混合液、RED工作混合液、苏木素对细胞制片1进行p16/Ki
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67免疫组织化学染色；采用TOP2A/MCM2一抗工作液、羊抗鼠/兔二抗工作混合液、RED工作混合液、苏木素对细胞制片2进行MCM2免疫组织化学染色；结合染色结果、细胞数量和细胞核面积，得出判定结果，具体如上表所示。4.根据权利要求3所述的以p16/Ki
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67、TOP2A/MCM2为靶标的宫颈癌检测试剂盒的判读方法，其特征在于，配制p16/Ki
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67一抗工作混合液：首先将抗体稀释液和p16一抗浓缩液混合，再加入到Ki
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【专利技术属性】
技术研发人员：李克强，姚远颋，许舟，顾重建，
申请(专利权)人：重庆沃康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：