新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，尤其涉及新型鹅星状病毒(GoAstV)和鸭坦布苏病毒(DTMUV)多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用。本申请中分别针对DTMUV的E基因与GoAstV的ORF1b基因，设计特异性引物和探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时检测DTMUV、GoAstV的荧光定量PCR方法。该方法具有特异、敏感、高效的优点。效的优点。效的优点。

【技术实现步骤摘要】
新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于病毒检测
，尤其涉及新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]2017年以来，华东地区多个鹅场暴发了以雏鹅痛风为主要临床特征的疾病，主要感染4～16日龄的雏鹅，导致约2％～20％的死亡率，死亡鹅表现为肾发白肿胀、胸腹膜及心表面、输尿管中存在大量的尿酸盐沉积，给养鹅业造成了很大的损失。经分离鉴定发现，该病是由一种星状病毒感染所导致，该毒株与以往报道的禽星状病毒具有很大的差异，其全基因组同源性为46.5％～62.0％，编码衣壳蛋白的ORF2基因氨基酸序列的同源性仅为27.3％～57.0％，与禽星状病毒属的其他代表性毒株的遗传距离较远，是一种新发的星状病毒。
[0003]2010年4—6月份，中国福建、浙江、江苏、安徽、山东等地的产蛋鸭相继爆发以产蛋下降为特征的一种新病，该病发病急、传播快，发病对象主要集中于各个产蛋阶段的麻鸭和樱桃谷种鸭。鸭发病后，产蛋率从90％—95％下降到10％以下，甚至绝产。其剖检变化主要表现为卵泡出血、破裂和卵黄性腹膜炎，死亡率在1％—5％。研究证明引起该病的病原为黄病毒科黄病毒属的坦布苏病毒(Tembusuvirus，TMUV)，该病暂命名为坦布苏病毒病(Tembusu virus disease，TMUVD)。有研究表明，鸭坦布苏病毒也会感染鹅，造成鹅产蛋下降，建立新型鹅星状病毒和坦布苏病毒的多重荧光定量PCR检测方法对水禽疫病防控具有重要意义。
[0004]目前已有研究关于坦布苏病毒荧光定量PCR方法的建立和新型鸭细小病毒SYBR GreenΙ荧光定量PCR检测方法的建立，但是新型鹅星状病毒和鸭坦布苏的多重荧光定量PCR方法还未见报道。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量PCR检测引物探针组、试剂盒及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
[0006]一种快速检测新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒的多重引物和探针，包括：鸭坦布苏病毒的上、下游引物分、鸭坦布苏病毒特异性探针和新型鹅星状病毒的上、下游引物、新型鹅星状病毒特异性探针；
[0007]所述鸭坦布苏病毒的上、下游引物分、鸭坦布苏病毒特异性探针为：
[0008]上游引物：5
’‑
TTGTTGTCCTTGCTGAAGGC
‑3’
(SEQ ID NO.1)
[0009]下游引物：5
’‑
CATTGGGAGGACCGAAGAGT
‑3’
(SEQ ID NO.2)
[0010]鸭坦布苏病毒特异性探针：5
’‑
CTGTCGCGGCACGAGCTCGT
‑3’
(SEQ ID NO.3)
[0011]所述新型鹅星状病毒的上、下游引物、新型鹅星状病毒特异性探针为：
[0012]上游引物：5
’‑
CTGCACAAGTTGGTTGGACA
‑3’
(SEQ ID NO.4)
[0013]下游引物：5
’‑
CATCATAACGCGTCCAGTCC
‑3’
(SEQ ID NO.5)
[0014]新型鹅星状病毒特异性探针：5
’‑
ACCTGTCACCACCACCAATGAGCC
‑3’
(SEQ ID NO.6)该多重引物探针组的特异性好、灵敏度高。
[0015]在一些实施例中，鸭坦布苏病毒特异性探针在5
’
端标记6
‑
FAM荧光基团，在3
’
端标记BHQ1淬灭基团；新型鹅星状病毒特异性探针在5
’
端标记CY5荧光基团，在3
’
端标记BHQ1淬灭基团。
[0016]本专利技术还提供一种上述检测鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒的多重引物探针在制备特异性多重检测鸭坦布苏病毒和新型鹅星状病毒试剂中的应用。
[0017]本专利技术还提供一种用于检测新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒的试剂盒，包括试剂2
×
AceQ Qpcr Probe Master Mix、MoCl3、50
×
ROX Reference Dye 1和上述的多重引物和探针组。
[0018]在一些实施例中，所述MoCl3的浓度为2.0mmol
‑
3.0mmol。
[0019]本专利技术还提供一种用于新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒多重荧光定量PCR的检测方法，配置多重PCR反应体系：检测样品cDNA 1.0μL、2
×
AceQ Qpcr Probe Master Mix 10μL、浓度为10μM的新型鹅星状病毒上下游引物和浓度为10μM的鸭坦布苏病毒上下游引物各0.4μL、浓度为10μM的新型鹅星状病毒特异性探针和浓度为10μM的鸭坦布苏病毒探针各0.2μL、50
×
ROX Reference Dye 1 0.4μL和ddH2O 6.6μl。
[0020]在一些实施例中，多重荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火和延伸30s，40次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的优点及积极效果为：
[0022]为建立鉴别检测坦布苏病毒(DTMUV)、新型鹅星状病毒(GoAstV)的方法，本申请中分别针对DTMUV E基因与GoAstV的ORF1b基因，设计特异性引物和TaqMan探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时检测DTMUV、GoAstV的TaqMan荧光定量RT
‑
PCR方法。该方法具有特异、敏感、高效的优点。
附图说明
[0023]图1是实验方案优化设计图；
[0024]图2是DTMUV标准品单独扩增曲线；
[0025]图3是GoAstV标准品单独扩增曲线；
[0026]图4是混合标中的DTMUV扩增曲线；
[0027]图5是混合标中的GoAstV扩增曲线；
[0028]图6是DTMUV样品单独扩增曲线；
[0029]图7是GoAstV样品单独扩增曲线；
[0030]图8是混合样品中的DTMUV样品扩增曲线；
[0031]图9是混合样品中的GoAstV样品扩增曲线；
[0032]图10针对新型鹅星状病毒(GoAstV)的ORF1a基因设计的引物和探针扩增效果图；
[0033]图11是表2中GoAstV(ORF2基因)
‑
1的引物和探针扩增效果图；
[0034]图12是表2中GoAstV(ORF2基因)
‑
2的引物和探针扩增效果本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测新型鹅星状病毒和鸭坦布苏病毒的多重引物和探针，其特征在于：包括鸭坦布苏病毒的上、下游引物、鸭坦布苏病毒特异性探针和新型鹅星状病毒的上、下游引物、新型鹅星状病毒特异性探针；所述鸭坦布苏病毒的上、下游引物分、鸭坦布苏病毒特异性探针为：上游引物：5
’‑
TTGTTGTCCTTGCTGAAGGC
‑3’
(SEQ ID NO.1)；下游引物：5
’‑
CATTGGGAGGACCGAAGAGT
‑3’
(SEQ ID NO.2)；鸭坦布苏病毒特异性探针：5
’‑
CTGTCGCGGCACGAGCTCGT
‑3’
(SEQ ID NO.3)；所述新型鹅星状病毒的上、下游引物、新型鹅星状病毒特异性探针为：上游引物：5
’‑
CTGCACAAGTTGGTTGGACA
‑3’
(SEQ ID NO.4)；下游引物：5
’‑
CATCATAACGCGTCCAGTCC
‑3’
(SEQ ID NO.5)；新型鹅星状病毒特异性探针：5
’‑
ACCTGTCACCACCACCAATGAGCC
‑3’
(SEQ ID NO.6)。2.根据权利要求1所述的多重引物和探针，其特征在于：所述鸭坦布苏病毒特异性探针在5
’
端标记6
‑
FAM荧光基团，在3
’

【专利技术属性】
技术研发人员：李海琴，杨群，张帆帆，谭美芳，康昭风，傅秋玲，曾艳兵，季华员，黄江南，傅光华，韦启鹏，黄瑜，谭佳，吴诚诚，方绍培，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：