同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法技术

本发明专利技术提供了一种同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法，包括针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2

【技术实现步骤摘要】
同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法


[0001]本专利技术属于动物疫病的检测方法
，具体涉及一种同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着中国养猪业规模化、集约化发展，猪传染性疾病的发生和流行对生猪养殖的危害日趋加重，且多病原混合感染已成为当前猪群疫病流行的主要形式与特点。在生猪养殖过程中猪繁殖障碍类疾病是兽医临床中发病率较高的一类疾病，而引起这类疾病的病因非常复杂，通常由多种因素影响。可将其分为传染性猪繁殖障碍疾病和非传染性猪繁殖障碍疾病两类，规模化生猪养殖过程中主要受到传染性猪繁殖障碍疾病的侵害，例如猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等，其症状有母猪不孕不育、流产、早产、产畸形胎、死胎、木乃伊，产弱仔，母猪发情异常，公猪出现睾丸炎、睾丸萎缩等。
[0003]值得注意的是，猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪伪狂犬病毒在临床诊断过程中具有比较相似的临床症状而较难确诊，常常导致无法及时发现疫病的传播。现有技术中公开了大量检测上述病毒的方法，如中国专利(申请公布号CN108265126A)公开了一种同时检测猪圆环病毒3型和猪圆环病毒2型的PCR方法，其分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计两对特异性引物，建立了二重PCR检测方法，以实现对猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型快速准确检测并鉴定的目的。
[0004]如中国专利(申请公布号CN102071258A)公开了一种猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，其能同时检测猪细小病毒与猪伪狂犬病毒两种病毒，不能检测出猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，具有较好的特异性、重复性和敏感性，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。
[0005]如中国专利(申请公布号CN102071257A)公开了一种猪细小病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性。
[0006]如中国专利(申请公布号CN102071256A)公开了猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，其能够同时检测PC V2、PRV两种DNA病毒，能最少检测180拷贝猪伪狂犬病毒质粒和215拷贝猪圆环病毒2型质粒，具有较好的敏感性、重复性与稳定性，有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。
[0007]如中国专利(申请公布号CN112553372A)公开了一种猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型双重荧光定量PCR检测引物和探针、试剂盒及方法，其提供的引物探针、扩增试剂和方法对猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒3型的检测具有良好的敏感性、特异性、重复性和稳定性。
[0008]如中国专利(申请公布号CN102382902A)公开了一种CSFV、PCV2与PP V多重SYBR Green I实时荧光PCR引物及其检测方法，其能够同时检测CSF V、PRV和PCV2三种DNA病毒，能最少检测183拷贝猪瘟病毒、231拷贝猪伪狂犬病毒和203拷贝猪圆环病毒2型。
[0009]如中国专利(申请公布号CN102071259A)公开了一种猪伪狂犬病毒、猪细小病毒与猪圆环病毒2型多重实时荧光PCR检测引物及方法，其能最少检测出189拷贝猪伪狂犬病毒质粒203拷贝猪细小病毒质粒和173拷贝猪圆环病毒2型质粒，具有的较好敏感性、重复性和稳定性，为PRV、PPV、PCV2的检测提供了一种新的方法可作为规模化猪场PRV、PPV、PCV2的净化检测方法。
[0010]再如中国专利(申请公布号CN106957925A)公开了一种能同时检测和鉴别伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的检测试剂盒及引物和探针，其可实现一次采样，一次分析，可同时检测和区分3种重要猪病的目的，减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防治赢得时间。
[0011]上述针对猪繁殖障碍相关病原的检测技术中，现有的荧光PCR检测方法一般都是针对一种或两种病原，较少同时针对三种相关病原，极少同时针对四种相关病原。目前，多种病原的检测成本高，步骤繁琐，且大多数为SYBR
‑
Green法，SYBR
‑
Green法对引物特异性要求极高，容易与非特异性双链DNA结合产生假阳性，检测方法的特异性有待进一步提高。并且，现有的双重或多重荧光PCR检测方法，大多使用的是不同质粒混合作为阳性模板的方式，对检测结果的灵敏度可能构成影响，且不能对不同病毒进行准确定量分析和比较。

技术实现思路

[0012]针对上述问题，本专利技术提供了一种同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针及其方法，具有较高的特异性和敏感性，可较好地适配于多通道荧光PCR仪，能有效应用于四种猪繁殖障碍相关病原的检测与分析，能在较短的时间内完成疾病的诊断检测，以为科学合理地制定防控措施提供有效工具。
[0013]本专利技术通过下述技术方案实现。
[0014]同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针，其包括：针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2
‑
cap、PCV3
‑
cap、PPV
‑
NS1和PRV
‑
gE的保守片段的引物和探针，具体的包括：
[0015]检测猪圆环病毒2型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
[0016]SEQ ID NO.1：5
’‑
TGTTTTCGAACGCAGTGC
‑3’
[0017]SEQ ID NO.2：5
’‑
ACTACTCCTCCCGCCATA
‑3’
[0018]SEQ ID NO.3：FAM
‑
5'
‑
CCAGCCCTTCTCCTACCACTCCC
‑3’‑
Tamra；
[0019]检测猪圆环病毒3型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：
[0020]SEQ ID NO.4：5'
‑
TGGTAGTTCCCGCCAGAA
‑3’
[0021]SEQ ID NO.5：5'
‑
TACGGGCACACAGCCATA
‑3’
[0022]SEQ ID NO.6：VIC
‑
5'
‑
GACGGCGCCTGGACCACAAACA<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针，其特征在于包括：针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2
‑
cap、PCV3
‑
cap、PPV
‑
NS1和PRV
‑
gE的保守片段的引物和探针，具体的包括：检测猪圆环病毒2型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：5
’‑
TGTTTTCGAACGCAGTGC
‑3’5’‑
ACTACTCCTCCCGCCATA
ꢀ‑3’
FAM
‑
5'
‑
CCAGCCCTTCTCCTACCACTCCC
‑3’‑
Tamra；检测猪圆环病毒3型的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：5'
‑
TGGTAGTTCCCGCCAGAA
‑3’
5'
‑
TACGGGCACACAGCCATA
‑3’
VIC
‑
5'
‑
GACGGCGCCTGGACCACAAACA
‑3’‑
Tamra；检测猪细小病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：5'
‑
CAACTACGCAGCAACTCC
‑3’
5'
‑
CGTATTGCTGAATCTGGC
‑3’
ROX
‑
5'
‑
TGGCTCGCTCCACGGCTCC
‑3’‑
BHQ2；检测猪伪狂犬病毒的上游引物、下游引物和探针，它们的序列分别为：5'
‑
CTCCTTCGTGATGACGTG
‑3’
5'
‑
TACACCGGKGAGAGCATG
‑3’
Cy5
‑
5'
‑
CGCGTCGGCACCCGGAA
‑3’‑
BHQ3。2.同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)DNA提取：提取待检测样品的总DNA，作为反应模板；(2)预混体系配制：配制所需的预混体系，所述预混体系中含有权利要求1所述的引物和探针；(3)反应组分配制：于预混体系中分别加入阴性对照物、阳性对照物和待检测样品，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：湛洋，陈媛，张露华，杨毅，王乃东，杨青，王昌建，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：