一种等温HIV核酸检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种等温HIV核酸检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括A管反应试剂和B管反应试剂；所述的A管反应试剂包括walker与Protect链、track单链、链霉亲和素磁珠、含NaCl的缓冲体系；所述的B管反应试剂包括金a、金b和Mg

【技术实现步骤摘要】
一种等温HIV核酸检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种快速便捷的等温HIV核酸检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]人类免疫缺陷病毒(HIV)的检测是艾滋病防治规划的关键组成部分，作为逆转录病毒，当其侵入细胞时，会将自身的RNA逆转录为DNA，整合到宿主细胞基因组中。目前对HIV的检测主要分为核酸检测和血清学检测。血清学检测的目标物为抗原或抗体，常用方法包括酶联免疫吸附法(De la Rica and Stevens,2012)、免疫荧光法(Pandori et al.,2013)和蛋白质印迹法(Zhou et al.,2015b)，市面上现有的可供个人检测的试纸一般采用ELISA法，检测的也是HIV抗体，但由于HIV抗体水平低，需要大约六周血液中才能检测到抗体。相比而言，HIV核酸检测将能将检测窗口期缩短至一周左右，因此病毒核酸检测对尽早防治疾病有重要意义。HIV核酸的常用检测方法为聚合酶链反应法(PCR，Ding et al.,2010)，此法具有高灵敏度和特异性，可检测RNA和DNA，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，最后通过比对标准曲线也可得到定量的结果。虽然PCR法作为核酸检测的常用方法较为成熟可靠，但是也有一些不足之处，如其对设备要求较高，需要热循环和复杂的引物设计，检测成本较高，时间也较长。因此，急需开发用于HIV感染早期诊断的简单、快速和灵敏的技术。
[0003]目前常用的核酸扩增技术有链置换扩增(SDA)、杂交链式反应(HCR)、滚环扩增(RCA)和DNA纳米机器等，其中DNA walker是DNA纳米机器的一种，它能够通过动态相互作用在线性、二维及三维轨道上进行自主且高方向性运动，可以应用于检测信号定向传导及放大，在核酸检测方面有良好的应用前景。例如，李峰团队在金球上构建了3D
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DNA walker，当目标DNA存在时，通过链置换反应释放walker，并利用核酸内切酶驱动，使walker沿着三维表面上的轨道分子高速行走并释放大量荧光标记的底物分子,从而快速检测血清样本中的结核杆菌DNA片段(文章：ACS Nano 2016,10,2,2324
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2330)。何治柯等设计了基于RCA反应和DNA walker的HIV核酸检测方法，让HIV靶标作为RCA反应的引物，而RCA的产物包含数百个重复序列，用于引发DNA walker的行走，释放荧光信号(文章：Nanoscale,2018,10,17206
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17211)。易钢等设计了双层的DNA walker用于HIV核酸检测，当目标物存在时，由熵驱动的DNA分子杂交反应被激活，使外层walker行走，内层walker链释放，内层walker由酶驱动，通过酶促反应剪切轨道分子产生荧光信号(文章：Biosensors and Bioelectronics,Volume 133,2019,243
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249)。梁国熙等设计了一个简单的检测miRNA的磁性DNA walker，利用目标物触发walker切割底物链，磁分离后，大量底物链与纳米金一起孵育，在高盐溶液中未修饰的纳米金因大量单链DNA存在而不聚集，因此目标物的浓度可以通过从灰黑色到紫色的颜色变化进行可视化(文章：Sensors and Actuators B:Chemical,Volume 337,2021,129813)。
[0004]现有的利用DNA walker进行HIV核酸检测的方法其结果大多以荧光呈现，但观测
荧光信号需一定的设备，无法直观显示，在实验室外更是难以操作，荧光基团的成本也较高，很难做到当场快速反映检测结果。而基于纳米金的比色分析法虽简单且低成本，可以用于现场检测，但其灵敏度较低，限制了其在核酸检测中的临床应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对
技术介绍
提出的技术问题提供一种快速便捷的等温HIV核酸检测试剂盒及检测方法。本专利技术的试剂盒检测过程无需复杂试剂和设备，可以尽量脱离实验室环境操作，并且将结果以可视化的方式呈现，直观快速地反映检测物的有无和大致的浓度范围，实现即时检测，便于实际应用。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种等温HIV核酸检测试剂盒，该试剂盒包括A管反应试剂和B管反应试剂；所述的A管反应试剂包括walker与Protect链、track单链、链霉亲和素磁珠、含NaCl的缓冲体系；所述的B管反应试剂包括金a、金b和Mg
2+
缓冲体系，所述的金a和金b是分别在纳米金的表面修饰a、b两种序列的DNA分子制成的。
[0008]所述的纳米金(直径约为13nm)是用柠檬酸钠还原法制备的，后分别在其表面修饰了a、b两种序列的DNA分子，为区分故在此处命名为金a、金b，所涉及的纳米金的制备方法和修饰方法为本领域技术人员公知的常规方法。
[0009]作为一种优选技术方案，所述A管反应试剂的制备方法包括以下步骤：
[0010](1)将walker与Protect链杂交，形成部分互补的杂交双链；
[0011](2)将链霉亲和素磁珠、步骤(1)制备的杂交双链、track单链共同分散在含NaCl的缓冲体系中得到反应体系；
[0012](3)将步骤(2)得到的反应体系在旋转混匀仪中反应12
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18小时得到修饰上DNA的磁珠；
[0013](4)洗去上清，将修饰上DNA的磁珠重新分散在含NaCl的缓冲体系中，得到A管反应试剂；
[0014]所述的B管反应试剂的制备方法为：
[0015]取金a和金b分散至Mg
2+
缓冲体系中，得到B管反应试剂。
[0016]进一步优选的，步骤(1)中所述的walker与Protect链以摩尔比1：2在37℃下杂交；步骤(2)中所述杂交双链：track单链(摩尔比)＝1:8，所述的反应体系中杂交双链的浓度为0.5μM。
[0017]进一步优选的，步骤(3)中所述反应的条件为：以20rpm转速室温旋转反应。
[0018]进一步优选的，制备B管反应试剂时，将金a和金b分散至Mg
2+
缓冲体系中，最终每种金的浓度为16
‑
20nM。
[0019]作为一种优选技术方案，所述walker与Protect链、track单链的核苷酸序列分别为：
[0020][0021]所述a、b两种序列的DNA分子分别为：
[0022] Sequence(5
’‑3’
)a序列的DNA分子TATGAAGTGATGGAT
‑
SHb序列的DNA分子TAGTGCATTTAACAT
‑
SH
[0023]进一步优选的，所述的链霉亲和素磁珠为直径1μM的链霉亲和素磁珠；所述含NaCl的缓冲体系为1
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种等温HIV核酸检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括A管反应试剂和B管反应试剂；所述的A管反应试剂包括walker与Protect链、track单链、链霉亲和素磁珠、含NaCl的缓冲体系；所述的B管反应试剂包括金a、金b和Mg
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缓冲体系，所述的金a和金b是分别在纳米金的表面修饰a、b两种序列的DNA分子制成的。2.根据权利要求1所述的等温HIV核酸检测试剂盒，其特征在于：所述A管反应试剂的制备方法包括以下步骤：(1)将walker与Protect链杂交，形成部分互补的杂交双链；(2)将链霉亲和素磁珠、步骤(1)制备的杂交双链、track单链共同分散在含NaCl的缓冲体系中得到反应体系；(3)将步骤(2)得到的反应体系在旋转混匀仪中反应12
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18小时得到修饰上DNA的磁珠；(4)洗去上清，将修饰上DNA的磁珠重新分散在含NaCl的缓冲体系中，得到A管反应试剂；所述的B管反应试剂的制备方法为：取金a和金b分散至Mg
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缓冲体系中，得到B管反应试剂。3.根据权利要求2所述的等温HIV核酸检测试剂盒，其特征在于：步骤(1)中所述的walker与Protect链以摩尔比1：2在37℃下杂交；步骤(2)中所述杂交双链：track单链＝1:8，所述的反应体系中杂交双链的浓度为0.5μM。4.根据权利要求2所述的等温HIV核酸检测试剂盒，其特征在于：步骤(3)中所述反应的条件为：以20rpm转速室温旋转反应。5.根据权利要求2所述的等温HIV核酸检测试剂盒，其特征在于：制备B管反应试剂时，将金a和金b分散至Mg
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缓冲体系中，最终每种金的浓度为16
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20nM。6.根据权利要求1、2或3所述的等温HIV核酸检测试剂盒，其特征在于：所述walker与Protect链、track单链的核苷酸序列分别为：track单链的核苷酸序列分别为：所述a、b两种序列的DNA分子分别为：Sequence(5...

【专利技术属性】
技术研发人员：田野，杨思畅，闵乾昊，徐子棋，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：