抗猪TCN1单克隆抗体及其生产和使用方法技术

公开了抗

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗猪TCN1单克隆抗体及其生产和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用/通过引用并入声明本申请根据35 USC
ꢀ§ꢀ
119(e)要求2019年8月9日提交的美国临时申请号62/884,711的权益。以上引用的专利/专利申请的全部内容明确地通过引用并入本文。
[0002]关于联邦资助的研究或开发的声明不适用。
[0003]背景钴胺素是一种必需的营养素和B
‑
复合物家族的天然水溶性维生素，其必须与内在因子组合才能被肠道吸收。维生素B12 (氰钴胺素)是造血、神经代谢、DNA和RNA产生以及碳水化合物、脂肪和蛋白代谢所必需的。维生素B12改善代谢循环中的铁功能，并在胆碱合成中协助叶酸。维生素B12代谢与叶酸的代谢相互关联，并且维生素B12的缺乏引起恶性贫血、巨幼细胞性贫血和神经损伤。
[0004]钴胺传递蛋白I (TCN1)，也称为咕啉结合蛋白(haptocorrin)、R
‑
因子和R
‑
蛋白，是由口腔的唾液腺产生的糖蛋白。在体内，TCN1主要用于通过产生TCN1/维生素B12复合物来保护钴胺素(维生素B12)免于胃中的酸降解。一旦复合物已经到达更中性的十二指肠，胰腺蛋白酶就降解TCN1，由此释放游离维生素B12，其现在结合内在因子以被回肠肠细胞吸收。
[0005]猪内在因子(HIF)制剂通常用于诊断性维生素B12测定。然而，猪TCN1(或猪TCN1、猪TCN1或猪R
‑
蛋白)是猪胃粘膜的粗提取物中的主要HIF
‑
相关蛋白污染物，并且HIF制剂中猪TCN1的存在可损害其中使用HIF制剂的任何B12测定法的完整性；因此，估计和/或除去HIF制剂中存在的任何TCN1是必要的。
[0006]然而，目前没有可用于从用于B12测定中的HIF制剂中估计和/或除去猪TCN1的抗猪TCN1单克隆抗体的商业来源。
[0007]因此，本领域需要克服现有技术的缺点和缺陷的抗猪TCN1单克隆抗体以及估计猪TCN1和/或从HIF制剂除去猪TCN1的新的和改进的方法。本公开涉及此类抗体、含有所述抗体的试剂盒以及产生和使用所述抗体的方法。
[0008]附图简述图1：根据Allen等人 (J. Biol. Chem. (1973) 248(10):3670
‑
3680)在维生素B12
‑
Sepharose的柱上从猪胃粘膜的粗粉末提取物纯化维生素B12结合蛋白的总级分，并且为了本公开的目的称为“部分纯化的猪R
‑
蛋白”。小图A：还原条件下的SDS
‑
PAGE显示该级分包含天然猪R
‑
蛋白(宽的70
‑
92 kDa条带)和猪内在因子(窄的55 kDa条带)。小图B：等电聚焦表明两种糖基化蛋白(猪R
‑
蛋白和猪内在因子)的等电点几乎相同(pI <4.5)。
[0009]图2：来自野猪的钴胺传递蛋白I (TCN1)(SEQ ID NO:1)和内在因子(HIF)(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列比对。选择与猪内在因子没有同源性的肽29
‑
39(在本文中也称为R1并指定为SEQ ID NO:2)、肽80
‑
89(在本文中也称为R2并指定为SEQ ID NO:3)和肽200
‑
215(在本文中也称为R3并指定为SEQ ID NO:4)，用于单克隆抗体生成。
[0010]图3：肽R1、R2和R3在蛋白球的表面上的位置显示于模型TCN1晶体结构(PDB 4KKJ)
的前视图(小图A)和顶视图(小图B)上。
[0011]图4：用不同的猪TCN1肽
‑
BSA缀合物免疫的A/J小鼠的免疫血清在用合成肽、肽
‑
OVA缀合物或部分纯化的天然猪R
‑
蛋白包被的ELISA板上滴定。如可以看出，所有动物都对各自的肽和肽
‑
OVA缀合物产生高抗体滴度；然而，只有来自R1
‑
BSA和R2
‑
BSA动物的血清结合部分纯化的天然猪R
‑
蛋白。
[0012]图5：171B 1G5 mAb的抗原结合特性。该单克隆抗体针对R2
‑
BSA缀合物生成。如可以看出，171B 1G5 mAb对R2肽具有高度特异性，并且识别天然和重组猪TCN1蛋白。未观察到与猪内在因子的交叉反应性。
[0013]图6：在用合成肽或部分纯化的天然猪R
‑
蛋白包被的ELISA板上滴定用部分纯化的天然猪R
‑
蛋白免疫的Balb/C (A)和A/J (B)小鼠的免疫血清。如可以看出，两种品系的小鼠均对猪TCN1产生高抗体滴度，但对合成的R1、R2或R3肽则没有。
[0014]图7：选择产生针对天然猪TCN1的单克隆抗体的杂交瘤。在ELISA中针对与重组猪TCN1和部分纯化的天然猪
‑
R
‑
蛋白两者的结合筛选杂交瘤上清液。如可以看出，由171J 3F1和171J 3A6克隆产生的单克隆抗体与重组猪TCN1的结合比天然猪R
‑
蛋白好得多；单克隆抗体171J 9G7同样好地识别两种抗原，并且与重组R蛋白相比，171J 5H12 mAb更强烈地结合天然猪R
‑
蛋白。未观察到与猪内在因子的交叉反应性。
[0015]图8：针对猪TCN1肽微阵列测定的小鼠单克隆抗体的表位作图的概述。表位作图的结果证实mAb对猪TCN1具有特异性，并且对于171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6和171J 5H12抗体鉴定独特的线性表位。单克隆抗体171J 9G7不结合任何线性猪TCN1或猪内在因子肽。
[0016]图9：171B 1G5、171J 3F1、171J 3A6和171J 5H12抗体的线性表位的表面位置显示在模型TCN1晶体结构(PDB 4KKJ)的前视图(小图A)和顶视图(小图B)中。
[0017]图10：使用常规产生的171B 1G5单克隆抗体相对于重组产生的171B 1G5单克隆抗体的重组猪TCN1的ELISA滴定结果。如可以看出，该数据证实单克隆抗体的正确测序，因为两条滴定曲线是重叠的。
[0018]图11：在具有171J 5H12 mAb的柱上从猪胃粘膜的粉末粗提取物纯化的天然猪R
‑
蛋白亲和力。小图A：还原条件下用考马斯蓝R染色的SDS
‑
PAGE，显示天然猪R
‑
蛋白的样品(宽的70
‑
92 kDa条带)是同质的。小图B：等电聚焦，BioSafe Coomassie染色，显示天然猪TCN1是一种非常酸性的蛋白，其中pI <4.5。
[0019]图12：使用用单克隆抗体171J 5H12的ELISA测定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.能够特异性结合猪钴胺传递蛋白
‑
1 (TCN1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段选自：(A) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(B) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(C) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；(D) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；和(E) 抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链可变区CDR2、具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区CDR3、具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变区CDR2和具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：(A) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:3和20中的至少一个的至少一部分的猪TCN1的表位；(B) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:21的至少一部分的猪TCN1的表位；(C) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:22的至少一部分的猪TCN1的表位；或(D) 所述抗体或其抗原结合片段特异性结合包含SEQ ID NO:23的至少一部分的猪TCN1的表位。3.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其进一步定义为单克隆抗体或其抗原结合片段。4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：(A) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:7具有至少约90%同
一性的氨基酸序列；(B) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:25具有至少约90%同一性的氨基酸序列；(C) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:37具有至少约90%同一性的氨基酸序列；(D) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:49具有至少约90%同一性的氨基酸序列；或(E) 所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与SEQ ID NO:61具有至少约90%同一性的氨基酸序列。5.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：(A) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:13具有至少约90%同一性的氨基酸序列；(B) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:30具有至少约90%同一性的氨基酸序列；(C) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:42具有至少约90%同一性的氨基酸序列；(D) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:54具有至少约90%同一性的氨基酸序列；或(E) 所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:66具有至少约90%同一性的氨基酸序列。6.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中：(A) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:7和13的氨基酸序列；(B) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:25和30的氨基酸序列；(C) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:37和42的氨基酸序列；(D) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:49和54的氨基酸序列；或(E) 所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:61和66的氨基酸序列。7.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其被进一步定义为选自全长免疫球蛋白分子、scFv、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2、 Fv、二硫化物连接的Fv及其组合。8.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其被进一步定义为纯化的抗体或其...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：美国西门子医学诊断股份有限公司，
类型：发明
国别省市：