针对iRhom2的蛋白结合物制造技术

本发明专利技术涉及一种蛋白结合物，其与人iRhom2结合，并且当与人iRhom2结合时抑制和/或降低TACE/ADAM17活性。TACE/ADAM17活性。TACE/ADAM17活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对iRhom2的蛋白结合物


[0001]本申请涉及针对iRhom2的蛋白结合物。

技术介绍

[0002]ADAM金属肽酶结构域17(ADAM17)(人ADAM17的NCBI参考:NP_003174)也称为TACE(肿瘤坏死因子
‑
α
‑
转化酶)，是属于去整合素和金属蛋白酶的ADAM蛋白家族的70
‑
kDa酶。其为824个氨基酸的多肽。
[0003]ADAM17被理解为参与肿瘤坏死因子α(TNF
‑
α)在细胞表面的加工，并来自反面高尔基网的胞内膜之内。该过程(也称为“脱落(shedding)”)涉及从膜结合的前蛋白(如pro
‑
TNF
‑
α)切割和释放可溶性胞外域，并且具有已知的生理学重要性。ADAM17是首个被鉴定的“脱落酶”，并且还理解为在各种各样的膜锚定细胞因子、细胞粘附分子、受体、配体和酶的释放中发挥作用。
[0004]TNF
‑
α基因的克隆显示出其编码26kDa II型跨膜前多肽，其在内质网中易位期间插入细胞膜中。在细胞表面，pro
‑
TNF
‑
α呈生物活性，并且能够经由近分泌胞间信号传导来诱导免疫应答。然而，pro
‑
TNF
‑
α可在其Ala76
‑
Val77酰胺键处经历蛋白水解切割，其从pro
‑
TNF
‑
α分子中释放出可溶性17kDa胞外结构域(胞外域)。该可溶性胞外域是通常称为TNF
‑
α的细胞因子，其在该分子的旁分泌信号传导中至关重要。可溶性TNF
‑
α的这种蛋白水解释放由ADAM17催化。
[0005]ADAM17还通过调节乳腺中EGFR配体双调蛋白的切割来调节MAP激酶信号传导途径。此外，ADAM17在细胞粘附分子L
‑
选择素的脱落中起作用。
[0006]最近，ADAM17被发现是放疗抗性形成的关键介质。放疗可以诱导弗林蛋白酶介导的ADAM17前型切割为活性ADAM17的剂量依赖性增加，这导致体外和体内增强的ADAM17活性。还显示放疗活化非小细胞肺癌中的ADAM17，其导致多种存活因子脱落、生长因子途径活化，以及放疗诱导的治疗抗性。
[0007]由于ADAM17似乎是包括TNFα在内的不同病原性和非病原性因子释放的关键因素，其作为治疗靶分子已成为关注的焦点。为此，已经作出了不同的尝试来开发ADAM17的抑制剂。
[0008]然而，迄今为止，尚未证明此类抑制剂在临床上是成功的。
[0009]因此，本专利技术的一个目的在于提供允许控制、调节、降低或抑制ADAM17活性的新方法。
[0010]本专利技术的另一个目的在于提供允许治疗炎性疾病的新方法。
[0011]这些和其他目的通过独立权利要求的特征得到解决。从属权利要求公开可在特定情况下优选的本专利技术的实施方案。同样，本说明书公开可在特定情况下优选的本专利技术的其他实施方案。

技术实现思路

[0012]本专利技术尤其提供了一种蛋白结合物，其与人iRhom2结合并且当与人iRhom2结合时抑制和/或降低TACE/ADAM17活性。
附图说明
[0013]图1显示用于免疫和肽结合ELISA分析的本文所用的肽的序列。这些肽是整个iRhom2或iRhom1序列的亚序列。为了增加免疫原性，一些肽经由半胱氨酸的SH基团与KLH(钥孔戚血蓝蛋白)缀合。相反，对于肽结合分析，这些肽与生物素缀合。为此目的，使用天然存在于各个肽的N或C末端的半胱氨酸，或者将半胱氨酸添加到N或C末端(图1中标记为
“‑
C
‑”
)。为了避免KLH和/或生物素的非特异性链内二硫键形成或非特异性链内缀合，链内半胱氨酸被氨基丁酸(在图1中标记为“Abu”)取代。
[0014]图2显示用于功能性筛选杂交瘤上清液的TNFα释放测定(脱落测定)的结果，表明杂交瘤克隆4H8的上清液有效地干扰THP
‑
1细胞中LPS诱导的TNFα脱落。
[0015]图3示出抗体同种型确定的ELISA分析结果，表明本专利技术的抗体4H8
‑
E3为小鼠IgM同种型。
[0016]图4显示肽结合ELISA分析的结果，显示出本专利技术的抗体4H8
‑
E3识别人iRhom2的大胞外环1部分(“近膜结构域”，JMD)内的表位，该部分邻近第一“跨膜结构域”(TMD1)。
[0017]本专利技术的抗体4H8
‑
E3识别肽3，其对应于人iRhom2的第431至459位氨基酸，即邻近TMD1的人iRhom2的大胞外环1的JMD部分(“近膜结构域”)。
[0018]图5显示肽结合ELISA分析的结果，显示出本专利技术的抗体4H8
‑
E3识别人iRhom2的邻近TMD1的胞外近膜区内的表位，但不识别人iRhom1的同源区内的表位。本专利技术的抗体4H8
‑
E3识别肽3，但不识别肽3b，其对应于人iRhom1的相应同源部分。
[0019]图6显示TNFα释放测定的结果，表明本专利技术的抗体4H8
‑
E3抑制THP
‑
1细胞中LPS诱导的TNFα脱落。
[0020]图7显示TNFα释放测定的结果，表明在THP
‑
1细胞中本专利技术的抗体4H8
‑
E3对LPS诱导的TNFα脱落的浓度依赖性抑制。
[0021]图8显示iRhom2的示意图，其中说明邻近TMD1的近膜结构域(A)、环1(B)和C末端(C)的位置。
[0022]图9示出根据SEQ ID NO 16的人iRhom2的氨基酸序列，所示序列对应于本专利技术所用的免疫肽。
[0023]图10显示根据SEQ ID NO 16的人iRhom2和根据SEQ ID NO 17的人iRhom1的比对。灰色区域显示对应于本专利技术所用的免疫肽3的序列。
[0024]专利技术详述
[0025]根据本专利技术的一个方面，提供了一种蛋白结合物，其与人iRhom2结合，并且当与人iRhom2结合时抑制和/或降低TACE/ADAM17活性。
[0026]菱形家族成员2(iRhom2)是人体内由RHBDF2基因编码的蛋白质。其为由约850个氨基酸组成的跨膜蛋白，具有七个跨膜结构域。本专利技术的专利技术人首次表明iRhom2可充当蛋白结合物的靶标以抑制TACE/ADAM17活性。
[0027]iRhom2有不同的同种型(isoform)。本文进行的实验已经用定义为NCBI参考NP_
078875.4的同种型建立。然而，教导内容可非限制性地转换到iRhom2的其他同种型，如下表所示：
[0028][0029]如本文所用，术语“抑制和/或降低TACE/ADAM17活性”意在描述由阻断或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种蛋白结合物，其与人iRhom2结合，并且当与人iRhom2结合时抑制和/或降低TACE/ADAM17活性。2.根据权利要求1所述的蛋白结合物，其为单克隆抗体、或其保留靶结合能力的靶结合片段或衍生物、或抗体模拟物。3.根据权利要求1或2所述的蛋白结合物，其中TACE/ADAM17活性的抑制或降低由干扰iRhom2介导的TACE/ADAM17活化引起。4.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其抗体抑制或减少TNFα脱落。5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其中所述蛋白结合物所结合的所述人iRhom2包含：a)SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO 16具有至少80％序列相同性的氨基酸序列，条件是所述序列保持iRhom2活性。6.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其与人iRhom2的邻近跨膜结构域1(TMD1)的近膜结构域结合。7.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其与人iRhom2的包含以下的氨基酸序列结合：a)至少SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列，或b)与SEQ ID NO 3具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。8.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其与人iRhom2的一个或多个氨基酸序列结合，所述人iRhom2的一个或多个氨基酸序列各自包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列内的一个或多个氨基酸。9.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其与选自A431、Q432、H433、V434、T435、T436、Q437、L438、V439、L440、R441、N442、K443、G444、V445、Y446、E447、S448、V449、K450、Y451、I452、Q453、Q454、E455、N456、F457、W458、V459的至少一个氨基酸残基结合，其中所述氨基酸残基的编号参考SEQ ID NO16(人iRhom2)所示的氨基酸序列。10.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其不与人iRhom1、或其邻近跨膜结构域1(TMD1)的近膜结构域交叉反应。11.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其为呈选自以下形式中的至少一种的抗体：IgG、scFv、Fab、(Fab)2。12.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其为具有选自IgG、IgM的同种型的抗体。13.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其为小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、或人抗体。14.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其为抗体4H8
‑
E3。15.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，其为包含4H8
‑
E3的可变结构域或CDR的抗体。16.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白结合物，所述蛋白结合物a)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含在SEQ ID NO 33和40所示的重链/轻链可变区序列对中，
b)包含一组重链/轻链互补决定区(CDR)，其包含以下序列：
·
HC CDR1(SEQ ID NO 34或37)
·
HC CDR2(SEQ ID NO 35或38)
·
HC CDR3(SEQ ID NO 36或39)
·
LC CDR1(SEQ ID NO 41或44)
·
LC CDR2(SEQ ID NO 42或45)，以及
·
LC CDR3(SEQ ID NO 43或46)c)包含b)的重链/轻链互补决定区(CDR)，条件是CDR中的至少一者相对于相应的SEQ ID NO 34
‑
39或...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：希罗姆有限责任公司，
类型：发明
国别省市：