用于使用经改造的泛素连接酶的遗传编码的高电压激活钙通道阻断剂的组合物和方法技术

本公开内容尤其提供了靶向Ca

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使用经改造的泛素连接酶的遗传编码的高电压激活钙通道阻断剂的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年8月14日提交的美国临时专利申请系列号62/886,733、2019年8月6日提交的美国临时专利申请系列号62/883,637、2019年5月30日提交的美国临时专利申请系列号62/854,688、2019年4月5日提交的美国临时专利申请系列号62/830,142和2019年3月28日提交的美国临时专利申请系列号62/825,784的权益，这些申请通过提及而以其整体合并入本文。
[0003]公开内容的领域
[0004]本公开内容尤其提供了遗传编码的高电压激活钙通道(High
‑
Voltage Activated Calcium Channel；HVACC)抑制剂(包括靶向Ca
V
β辅助亚基的纳米抗体)及其组合物。本专利技术还提供了使用其的治疗方法。
[0005]政府资助
[0006]本专利技术用在由美国国立卫生研究院(NIH)授予的基金号GM107585、DK118866和HL142111之下的政府资助来完成。政府拥有本专利技术中的某些权利。
[0007]序列表通过提及而合并
[0008]本申请包含对于已经作为序列表TXT文件“CU19283
‑
pro4
‑
seq.txt”(文件大小43KB，于2019年8月6日创建)与本文同时提交的氨基酸和/或核酸序列的引用。上面提及的序列表依照37C.F.R.
§
1.52(e)(5)通过提及而以其整体合并入本文。
[0009]公开内容的背景
[0010]高电压激活钙通道(HVACC)对于可兴奋细胞例如神经元的功能是关键性的。它们允许神经递质、激素的释放，并且起始骨骼肌和心肌两者的收缩。因此，钙通道阻断剂已成为用于各种不同疾病诸如高血压、心律失常、糖尿病、帕金森病和慢性疼痛的突出的药物靶标。最后一种疾病据估计影响全球人口的20％，具有巨大的经济和社会后果。尽管该大的流行率，但是目前用于慢性疼痛的治疗仍然是不适当的，如用导致阿片样物质流行的用于慢性疼痛的常见治疗所例示的。
[0011]在HVACC之中，N
‑
型钙通道是用于治疗慢性疼痛的主要靶标。已确立，这些通道在传递疼痛感觉的感觉神经元中表达，阻断这些通道可以使疼痛知觉中断，并且这些通道在多种疼痛模型中被上调。源自海洋蜗牛毒液的N
‑
型钙通道阻断剂(Prialt)目前在有限的情形下用于疼痛管理，但是受限于狭窄的治疗窗。在特定组织中减少/抑制HVACC的治疗潜力超出了疼痛范围：钙通道阻断剂目前在临床试验中用于治疗糖尿病以及帕金森病。所有目前的药物都通过破坏其允许钙进入细胞的能力而在其功能位置(质膜)处阻断所述通道。鉴于它们在许多细胞中的中枢重要性，对于所有目前的药理学HVACC阻断剂的主要关切是脱靶效应。
[0012]大多数针对HVACC的药物靶向所述通道的孔形成性α1亚基，从而破坏所述通道允许钙进入细胞的能力。HVACC也由辅助性β和α2‑
δ亚基组成，它们的功能是促进α1亚基运输至质膜，并且一旦在那里就微调其特性。作为通道功能的关键调节剂，这些辅助亚基是潜在的
治疗靶标。事实上，加巴喷丁(普瑞巴林或乐瑞卡(Lyrica))用于治疗慢性疼痛，并且通过经由与所述通道的α2‑
δ亚基的联合下调N
‑
型钙通道来工作(这如何发生的准确机制正在深入研究中)。相比于其他治疗选项例如阿片样物质或三环类抗抑郁药而言，基于加巴喷丁的治疗产生更少的副作用，但是完全缓解疼痛是很少见的。因此，非常需要经改进的用于这种常见状况的治疗选项。辅助性β亚基对于正确的通道运输是必须的。然而，尽管进行了靶向α1‑
β结合界面的努力，但是该亚基仍然是未利用的治疗靶标。
[0013]目前，还不存在有特异性地阻断所有HVACC的遗传编码的分子或工具。天然出现的遗传编码的抑制剂例如RGK蛋白结合其他蛋白质并且影响其他细胞过程，例如调节细胞骨架。这意味着，必须共施用HVACC阻断剂的混合物，其中一些是昂贵的源自毒液的肽。
[0014]因此，对于遗传编码的HVACC抑制剂以及用于治疗各种与HVACC相关的疾病的组合物和方法存在需要。本公开内容旨在满足这些和其他需要。
[0015]公开内容的概述
[0016]抑制高电压激活钙通道(HVACC；Ca
V
1/Ca
V
2)可治疗无数的心血管疾病和神经病学疾病。对于特定应用，遗传编码的HVACC阻断剂可以使得以比用小分子可取得的更大的组织特异性和通用性来进行通道抑制成为可能。在本公开内容中，通过首先分离结合辅助性HVACC Ca
V
β亚基的经免疫接种的美洲驼的纳米抗体(nb.F3)来改造遗传编码的HVACC抑制剂。nb.F3本身是在功能上惰性的，从而提供了方便的用于将活性部分靶向Ca
V
β
‑
相关通道的运载体。与Nedd4L(一种E3泛素连接酶)的催化性HECT结构域相融合的nb.F3(Ca
V
‑
消融剂(Ca
V
‑
aβlator))除去来自在HEK293细胞中重构的各种各样HVACC以及来自在哺乳动物心肌细胞、背根神经节神经元和胰腺β细胞中的内源性Ca
V
1/Ca
V
2通道的电流。在心肌细胞中，Ca
V
‑
消融剂将Ca
V
1.2通道从二分体重新分配至Rab
‑7‑
阳性晚期内体。本公开内容引入Ca
V
‑
消融剂作为强有力的遗传编码的HVACC抑制剂，并且描述了可以广泛地适应于产生用于大分子膜蛋白复合物的通用调节剂的一般方法。
[0017]因此，本公开内容的一个实施方案为能够与Ca
V
β辅助亚基相结合的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:1
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3、SEQ ID NO:5
‑
7、SEQ ID NO:9
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11、SEQ ID NO:13
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‑
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57、SEQ ID NO:59<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.能够与Ca
V
β辅助亚基相结合的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:1
‑
3、SEQ ID NO:5
‑
7、SEQ ID NO:9
‑
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31、SEQ ID NO:33
‑
35、SEQ ID NO:37
‑
39、SEQ ID NO:41
‑
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‑
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‑
93或SEQ ID NO:95
‑
97。2.权利要求1的纳米抗体，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:98。3.组合物，其包含：(i)根据权利要求1
‑
2中任一项的纳米抗体；和(ii)与所述纳米抗体可操作地相连的E3泛素连接酶的催化结构域。4.权利要求3的组合物，其中所述组合物对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。5.权利要求4的组合物，其中所述HVACC选自由下列各项组成的组：Ca
V
1.1、Ca
V
1.2、Ca
V
1.3、Ca
V
1.4、Ca
V
2.1、Ca
V
2.2、Ca
V
2.3及其组合。6.权利要求5的组合物，其中所述HVACC为Ca
V
1.2、Ca
V
1.3、Ca
V
2.1和Ca
V
2.3中的一种或多种。7.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于实现所述HVACC的功能敲低来说是有效的。8.权利要求4的组合物，其中所述E3泛素连接酶包含Nedd4
‑
2的催化结构域。9.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于削弱Ca
V
β辅助亚基将所述HVACC运输至质膜的功能来说是有效的。10.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于取消所有HVACC的表面水平来说是有效的。11.权利要求4的组合物，其中所述组合物对于降低或消除HVACC电流来说是有效的。12.组合物，其包含遗传编码的钙通道阻断剂，所述遗传编码的钙通道阻断剂包含编码下列组分的核酸：(i)根据权利要求1
‑
2中任一项的纳米抗体；和(ii)E3泛素连接酶的催化结构域。13.权利要求12的组合物，其中所述E3泛素连接酶包含Nedd4
‑
2的催化结构域。14.权利要求12的组合物，其中所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域是在功能上相连接的。15.权利要求12的组合物，其中表达所述纳米抗体和所述E3泛素连接酶的催化结构域以形成连续多肽。16.权利要求15的组合物，其中所述连续多肽对于将高电压激活钙通道(HVACC)从其在细胞质膜上的功能位置处移除来说是有效的。
17.权利要求16的组合物，其中所述HVACC选自由下列各项组成的组：Ca
V
1.1、Ca
V
1.2、Ca
V
1.3、Ca
V
1.4、Ca
V
2.1、Ca
V
2.2、Ca
V
2.3及其组合。18.权利要求17的组合物，其中所述HVACC为Ca
V
1.2、Ca
V

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：