本发明专利技术涉及一种通过引入一对二硫键进行含三对二硫键多肽的固相合成方法，具体公开了该方法包括以下步骤：1)以固相合成方法合成第一多肽片段和固相合成树脂的偶联物，所述第一多肽片段中包含形成第一对二硫键的两个半胱氨酸；2)将第一多肽片段中第一对二硫键的两个半胱氨酸的巯基保护基脱除，并氧化形成第一对二硫键；3)继续以固相合成的方法继续合成剩余片段；4)脱除第三对二硫键的半胱氨酸的巯基保护基，形成第三对二硫键，然后脱除第二对二硫键的半胱氨酸巯基保护基，形成第二对二硫键；5)脱除其他保护基，裂解树脂，获得含有三对二硫键的多肽。本发明专利技术的方法能够使三对多肽均为选择性的脱除保护基，极大的降低了错配的可能性。性。性。
【技术实现步骤摘要】
一种通过引入一对二硫键进行含三对二硫键多肽的固相合成方法
[0001]本专利技术属于多肽合成领域，具体涉及一种通过引入一对二硫键进行含三对二硫键多肽的固相合成方法。
技术介绍
[0002]蛋白质和多肽类药物具有作用位点专一，疗效明确等优点，近年来，蛋白质和多肽类药物的研究和发展已经成为生物医药领域研究的一个热点。
[0003]二硫键是蛋白质或多肽分子中位于不同肽链或同一肽链的两个不同位点Cys的巯基(-SH)被氧化形成的S-S共价键。它可以将肽链折叠成特定的空间结构，在维持多肽和蛋白质的空间立体结构及由此决定的生物活性中发挥着重要的作用。二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界因素影响的稳定性就愈大。
[0004]在目前已上市的多肽药物中，就含好几种多对二硫键的多肽药物如：普卡那肽、齐考诺肽、利那洛肽等。因为富含多个Cys残基，由于二硫键连接位点的不同可能会形成多种异构体，如含3对二硫键的多肽其二硫键有15种不同的组合方式。除药物自身外还有其它14种不同二硫键错配异构体。在药物研发的过程中，对这些二硫键错配异构体杂质的研究在原料药或制剂的质量研究中是不可缺失的一部分。但如何合成一直都是令人头疼的难题。
[0005]以利那洛肽为例来说。利那洛肽(Linaclotide)是一种新型GC-C(肠上皮细胞尿苷酸环化酶C)受体激动剂。可激活肠上皮细胞顶端表面的GC-C受体，导致细胞内和细胞外环鸟苷酸增多。通过使氯和碳酸氢盐分泌进入肠腔增加，进而导致液体分泌增多以及大便通过加速，用于治疗成人慢传输型便秘和便秘型肠易激综合征(IBS-C)患者。它是由14个L-型氨基酸残基组成，其中6个Cys残基分别由二硫键相连。其结构序列为：NH
2-Cys
1-Cys
2-Glu-Tyr-Cys
5-Cys
6-Asn-Pro-Ala-Cys
10-Thr-Gly-Cys
13-Tyr-COOH(其中Cys1、Cys6，Cys2、Cys
10
及Cys5、Cys
13
分别由二硫键相连)。
[0006][0007]由于利那洛肽中含有6个半胱氨酸残基，其两两配对成3对二硫键，除了利那洛肽外，由于二硫键结合位点的不同会有其它14种不同的二硫键的错配异构体(见表1:其异构体命名为随机以IM-A,B
……
表示。)。
[0008]表1：Linaclotide及其二硫键错配异构体列表
[0009]命名杂质肽序LinaclotideH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-6，2-10，5-13)
IM-AH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-2，5-6，10-13)IM-BH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-5，2-6，10-13)IM-CH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-6，2-5，10-13)IM-DH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-10，2-13，5-6)IM-EH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-13，2-10，5-6)IM-FH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-2，5-13，6-10)IM-GH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-2，5-10，6-13)IM-HH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-13，2-5，6-10)IM-IH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-5，6-10，2-13)IM-JH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-10，2-5，6-13)IM-KH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-5，2-10，6-13)IM-LH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-6，2-13，5-10)IM-MH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-13，2-6，5-10)IM-NH-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(1-10，2-6，5-13)
[0010]Benitez等人2010年进行了相关的报道(参见Peptide Science,2011,96:69-80)。该文献中采用三种方法对利那洛肽进行尝试性合成。
[0011]方法一：所有的Cys残基均采用Trt或Mmt为Cys的侧链保护基团，用Fmoc/tBu固相合成策略完成线性肽的合成，经裂解得到粗肽后用液相氧化的方法一步氧化得到目标肽。
[0012]方法二：Cys残基的巯基采用Trt或Mmt和Acm为Cys侧链保护基团(4Trt+2Acm或4Acm+2Trt)，用Fmoc/tBu固相合成策略得到部分保护的线性肽，然后用半选择的策略完成二硫键的合成。
[0013]方法三：分别采用3种不同的Cys的保护策略来进行正交保护，如[2Mmt+2Acm+2Trt]、[2Acm+2Trt+2pMeOBzl]、[2StBu+2Trt+2pMeOBzl]等三种完全选择性策略来进行二硫键的定位合成。
[0014]对于利那洛肽错配异构体的合成，上述方法一是不合适的。虽然合成步骤简单，只使用了一种Cys的保护基团。但是随机氧化可能会得到许多种不同的异构体，但却无法确定这些异构体的二硫键构成方式。
[0015]方法二为一种半选择性定位氧化的方法，先定位氧化一对二硫键，另外4个Cys残基自由组合成3种可能的异构体，此方法将形成的不同异构体数量降为了3种，虽理论上可以通过设计定位不同的二硫键得到异构体后对得到的异构体进行比对确认，但一是工作量巨大，其二通过这样的方式得到的错配异构体无法判定其二硫键结构的准确性。
[0016]对于方法三中采用对Cys巯本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种含3对二硫键的多肽的合成方法，其中，所述含3对二硫键的多肽中包含第一对二硫键，第二对二硫键和第三对二硫键，所述3对二硫键中至少一对二硫键是两个相邻半胱氨酸形成的，或者至少一对二硫键是相隔一个半胱氨酸的两个半胱氨酸形成的；所述合成方法包括以下步骤：1)以固相合成方法合成第一多肽片段和固相合成树脂的偶联物，所述第一多肽片段中包含形成第一对二硫键的两个半胱氨酸，形成第一对二硫键的两个半胱氨酸之间具有形成第二对二硫键的其中一个半胱氨酸，或者形成第一对二硫键的两个半胱氨酸之间不包含半胱氨酸；形成第一对二硫键的两个半胱氨酸的巯基以巯基保护基Trt或Mmt保护；形成第二对二硫键的其中一个半胱氨酸以巯基保护基Acm保护；2)将第一多肽片段中第一对二硫键的两个半胱氨酸的巯基保护基脱除，并氧化形成第一对二硫键；3)在固相条件下，继续以固相合成的方法继续合成剩余片段，剩余片段中包含形成第二对二硫键的半胱氨酸和形成第三对二硫键的半胱氨酸，其中形成第二对二硫键的半胱氨酸和形成第三对二硫键的半胱氨酸的巯基均以巯基保护基进行保护；形成第二对二硫键的两个半胱氨酸的巯基保护基相同，为Acm；形成第三对二硫键的半胱氨酸的巯基保护基相同，为Tr t或Mmt；4)脱除第二对二硫键的半胱氨酸的巯基保护基，形成第二对二硫键，然后脱除第三对二硫键的半胱氨酸巯基保护基，形成第三对二硫键；或者脱除第三对二硫键的半胱氨酸的巯基保护基，形成第三对二硫键，然后脱除第二对二硫键的半胱氨酸巯基保护基，形成第二对二硫键；5)脱除其他保护基，裂解树脂，获得含有三对二硫键的多肽。2.根据权利要求1所述的的合成方法，其特征在于，步骤2)中，脱除形成第一对二硫键的两个半胱氨酸的巯基保护基，并氧化形成二硫键的方法为：第一多肽片段中仅包含形成第一对二硫键的两个半胱氨酸，以1-20当量的碘溶于适量的DMF中，在室温条件下脱巯基保护基和形成二硫键；或者第一多肽片段中包含形成第一对二硫键的两个半胱氨酸以及形成第二对二硫键的一个半胱氨酸，采用TFA:TIS:DCM＝(1-5):(2-10):(97-85)脱除第一对二硫键的两个半胱氨酸巯基保护基，然后采用1-30当量的H2O2进行氧化成第一对二硫键。3.根据权利要求1-2任一项所述的的合成方法，其特征在于，步骤3)中，在固相条件下继续合成剩余片段的方法为，采用固相合成的方法进行合成，形成多肽片段和固相合成树脂的偶联物，所述多肽片段和固相合成树脂的偶联物中包含6个半胱氨酸，其中2个半胱氨酸已经形成二硫键；合成方法包括在多肽片段的N端增加氨基酸、以固相合成方法合成多肽片段，并将各多肽片段偶联，或者将单个增加氨基酸和片段偶联进行结合。4.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹卫星，尹传龙，唐洋明，余品香，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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