生产高度多样性肽文库和促进蛋白质折叠的方法技术

本公开提供具有增加的肽多样性的肽文库。肽多样性的增加可以通过肽内特定氨基酸的切割实现。本公开进一步提供一种用于促进肽折叠为活性构象的方法。为活性构象的方法。为活性构象的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产高度多样性肽文库和促进蛋白质折叠的方法
交叉引用
[0001]本申请要求2019年1月4日提交的美国临时申请第62/788,673号的权益，该申请通过引用全文纳入本文。

技术介绍

[0002]体外蛋白质生产允许表达和制造少量功能性蛋白质用于研究和治疗目的。通过引用纳入
[0003]本申请中引用的每篇专利、出版物和非专利文献通过引用全文纳入本文，就如同各自单独通过引用纳入。专利技术概述
[0004]本公开提供文库组合物，制备文库的方法，和促进肽折叠的方法。
[0005]在一些实施方式中，本公开提供文库，其包含编码多种肽的多种核酸构建体，其中多种核酸构建体的核酸构建体包含：a)编码选自多种肽的肽的第一核苷酸序列；和b)编码可切割部分的第二核苷酸序列，其中可切割部分的位置使得选自多种肽的肽的至少一个N
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末端氨基酸残基在可切割部分之前或之内；其中当使用对可切割部分特异的内切蛋白酶切割可切割部分时，多种肽包含超过1000种肽多样性，从而切割该肽的初始氨基酸残基。
[0006]在一些实施方式中，本公开提供包含多种肽的文库，其中多种肽的肽包含：a)肽的至少一个N
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末端氨基酸残基；b)可切割部分；和c)肽的剩余部分，其中肽的至少一个N
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末端氨基酸残基是在可切割部分之前或之内；其中当使用对可切割部分特异的内切蛋白酶切割可切割部分时，多种肽包括超过1000种肽多样性，从而切割该肽的至少一个N
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末端氨基酸残基。
[0007]在一些实施方式中，本公开提供制备肽文库的方法，该方法包括：a)提供编码多种肽的多种核酸构建体，其中多种核酸构建体的核酸构建体包含：i)编码来自多种肽的肽的第一核苷酸序列；以及ii)编码可切割部分的第二核苷酸序列，其中可切割部分的位置使得选自多种肽的肽的至少一个N
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末端氨基酸残基在可切割部分之前或之内；b)转录和翻译，或翻译，多种核酸构建体；c)使用内切蛋白酶切割可切割部分，可选地，与(b)同时进行，从而从肽的剩余部分切割肽的至少一个N
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末端氨基酸残基，其中来自该肽的至少一个N
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末端氨基酸残基的切割产生肽文库的恰当折叠肽。
[0008]在一些实施方式中，本公开提供用于表达蛋白质表位的DNA构建体，该DNA构建体包含：a)编码蛋白质表位的第一核苷酸序列；和b)编码蛋白质表位的N
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末端处的可切割部分的第二核苷酸序列，其中可切割部分的位置使得蛋白质表位的至少一个N
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末端氨基酸残基在可切割部分之前或之内，其中，该DNA构建体转录和翻译后，使用对可切割部分特异的内切蛋白酶切割可切割部分，从而切割蛋白质表位的至少一个N
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末端氨基酸残基，且其中蛋白质表位是肽文库的部分。
[0009]在一些实施方式中，本公开提供用于表达蛋白质表位的RNA构建体，该RNA构建体
包含：a)编码蛋白质表位的第一核苷酸序列；和b)编码蛋白质表位的N
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末端处的可切割部分的第二核苷酸序列，其中可切割部分的位置使得蛋白质表位的至少一个N
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末端氨基酸残基在可切割部分之前或之内，其中RNA构建体翻译后，使用对可切割部分特异的内切蛋白酶切割可切割部分，从而切割蛋白质表位的至少一个N
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末端氨基酸残基，且其中蛋白质表位是肽文库的部分。
[0010]在一些实施方式中，本公开提供折叠肽的方法，该方法包括：a)提供编码肽的核酸构建体，该核酸构建体包含：i)编码肽的第一核苷酸序列；以及ii)编码可切割部分的第二核苷酸序列，其中可切割部分的位置使得肽的至少一个N
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末端氨基酸残基在可切割部分之前或之内；b)转录和翻译，或翻译，核酸构建体；和c)使用内切蛋白酶切割可切割部分，可选地，与(b)同时进行，从而从肽的剩余部分切割肽的至少一个N
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末端氨基酸残基，其中该肽的至少一个N
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末端氨基酸残基的切割产生折叠的肽。
[0011]在一些实施方式中，本公开提供制备构象蛋白质表位文库的方法，该方法包括：a)获得由多种核酸构建体编码的多种蛋白质表位，其中多种核酸构建体中的核酸构建体进一步编码蛋白质表位N
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末端处的可切割部分，其中可切割部分的位置使得蛋白质表位的初始氨基酸残基在可切割部分之前或之内；b)可选地转录多种核酸构建体，其中多种核糖核酸分子被从多种核酸构建体中转录出来；c)翻译多种核糖核酸分子，其中多种蛋白质表位被从多种核糖核酸分子中翻译出来；和d)使用蛋白酶切割可切割部分，可选地，与(c)同时进行，从而从候选蛋白质表位的剩余部分切割候选蛋白质表位的初始氨基酸残基。
[0012]为了更好地理解本专利技术的本质和优势，参考以下与附图结合的详细说明。本专利技术能够在不偏离本专利技术的情况下进行各个方面的修改。因此，这些实施方式的附图和描述不是限制性的。附图简要说明
[0013]所附权利要求书中具体说明了本专利技术的新特征。可参考以下详述更好地理解本专利技术的特征和优点，这些详述阐述了利用本专利技术原理的说明性实施方式和附图，其中：
[0014]图1表示实施例1中生成的肽被消化以去除切割结构域。
[0015]图2显示使用本文所述方法制备的肽中切割SUMO结构域。
[0016]图3提供了使用本文所述方法制备的肽的正确折叠的定量。
[0017]图4提供了使用本文所述方法制备的肽的流式细胞术分析。专利技术详述定义
[0018]如本文所用，术语“可切割部分”指的是可切割的基序或序列。在一些实施方式中，可切割部分包含蛋白质，例如，酶促、可切割位点。在一些实施方式中，可切割部分包含化学可切割位点，例如，通过暴露于氧化/还原条件，光/声、温度、pH、压力等。
[0019]如本文所用，术语“内切蛋白酶”指的是切割非末端氨基酸的肽键的蛋白酶。
[0020]如本文所用，术语“高度多样性”指的是具有高度的多变性。
[0021]如本文所用，术语“文库肽”指的是文库内的单个肽。
[0022]如本文所用，术语“N
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末端氨基酸残基”指的是位于多肽的N
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末端的一个或多个氨基酸。
[0023]如本文所用，术语“肽多样性”指的是两种或更多肽之间的变化或可变性。
[0024]如本文所用，术语“肽文库”指的是多种肽。在一些实施方式中，文库包含具有独特序列的一种或多种肽。在一些实施方式中，文库中的每种肽具有不同的序列。在一些实施方式中，文库包含具有相同和不同序列的肽的混合物。
[0025]如本文所用，术语“高度多样性肽文库”指的是具有高度肽多变性的肽文库。例如，高度多样性肽文库包含约103种、约104种、约105种、约106种、约107种、约108种、约109种、约10
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种、约10
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种、约10
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种文库，其包含编码多种肽的多种核酸构建体，其中所述多种核酸构建体的核酸构建体包含：a)编码选自所述多种肽的肽的第一核苷酸序列；以及b)编码可切割部分的第二核苷酸序列，其中所述可切割部分的位置使得所述选自所述多种肽的肽的至少一个N
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末端氨基酸残基在所述可切割部分之前或之内；其中当使用对所述可切割部分特异的内切蛋白酶切割所述可切割部分时，所述多种肽包含超过1000种肽多样性，从而切割所述肽的初始氨基酸残基。2.如权利要求1所述的文库，其中所述选自所述多种肽的肽与靶受体结合。3.如权利要求1所述的文库，其中所述选自所述多种肽的肽结合选自下组的至少一种：抗体，免疫细胞受体(BCR、MHC、TCR)，细胞表面蛋白，激酶，蛋白酶，药物或其任意组合。4.如权利要求1
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3中任一项所述的文库，其中所述可切割部分是小泛素样修饰(SUMO)部分。5.如权利要求1
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3中任一项所述的文库，其中所述可切割部分是SEQ ID NO.:2。6.如权利要求1
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5中任一项所述的文库，其中所述内切蛋白酶是肠激酶。7.如权利要求1
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6中任一项所述的文库，其中所述内切蛋白酶是Ulp1肽酶。8.如权利要求1
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7中任一项所述的文库，其中所述至少一个N
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末端氨基酸残基是甲硫氨酸。9.如权利要求1
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8中任一项所述的文库，其中所述可切割部分的切割在所述核酸构建体的转录和翻译期间发生。10.如权利要求1
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9中任一项所述的文库，其中所述可切割部分的切割在所述核酸构建体的转录和翻译之后发生。11.如权利要求1
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10中任一项所述的文库，其中所述文库具有超过约103种、约104种、约105种、约106种、约107种、约108种、约109种、约10
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种、约10
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种、约10
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种、约10
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种或约10
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种肽多样性。12.如权利要求1
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11中任一项所述的文库，其中所述文库是肽文库。13.如权利要求1
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12中任一项所述的文库，其中所述核酸构建体是DNA构建体。14.如权利要求1
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13中任一项所述的文库，其中所述核酸构建体是RNA构建体。15.一种文库，其包含多种肽，其中所述多种肽的肽包含：a)所述肽的至少一个N
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末端氨基酸残基；b)可切割部分；以及c)所述肽的剩余部分，其中所述肽的至少一个N
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末端氨基酸残基在可切割部分之前或之内；其中当使用对所述可切割部分特异的内切蛋白酶切割所述可切割部分时，所述多种肽包括超过1000种肽多样性，从而切割所述肽的至少一个N
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末端氨基酸残基。16.如权利要求15所述的文库，其中所述多种肽的肽结合细胞受体。17.如权利要求15所述的文库，其中所述多种肽的肽结合T细胞受体(TCR)。18.如权利要求15
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17中任一项所述的文库，其中所述可切割部分是SEQ ID NO.:2。19.如权利要求15
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17中任一项所述的文库，其中所述可切割部分是小泛素样修饰(SUMO)部分。
20.如权利要求15
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19中任一项所述的文库，其中所述内切蛋白酶是肠激酶。21.如权利要求15
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19中任一项所述的文库，其中所述内切蛋白酶是Ulp1肽酶。22.如权利要求15
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21中任一项所述的文库，其中所述至少一个N
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末端氨基酸残基是甲硫氨酸。23.如权利要求15
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22中任一项所述的文库，其中所述多种肽的肽由第一核苷酸序列编码，其中所述第一核苷酸序列是DNA构建体的部分。24.如权利要求23所述的文库，其中所述DNA构建体进一步包括第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列编码所述可切割部分。25.如权利要求24所述的文库，其中所述可切割部分的切割在所述DNA构建体的转录和翻译期间发生。26.如权利要求24所述的文库，其中所述可切割部分的切割在所述DNA构建体的转录和翻译之后发生。27.如权利要求15
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22中任一项所述的文库，其中所述多种肽的肽由第一核苷酸序列编码，其中所述第一核苷酸序列是RNA构建体的部分。28.如权利要求27所述的文库，其中所述RNA构建体进一步包括第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列编码所述可切割部分。29.如权利要求27
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28中任一项所述的文库，其中所述可切割部分的切割在所述RNA构建体的翻译期间发生。30.如权利要求28
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29中任一项所述的文库，其中所述可切割部分的切割在所述RNA构建体的翻译之后发生。31.如权利要求15
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30中任一项所述的文库，其中所述文库具有超过约103种、约104种、约105种、约106种、约107种、约108种、约109种、约10
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种、约10
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种、约10
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种、约10
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种或约10
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种肽多样性。32.如权利要求15
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31中任一项所述的文库，其中，所述文库是肽文库。33.一种制备肽文库的方法，所述方法包括：a)提供编码多种肽的多种核酸构建体，其中所述多种核酸构建体的核酸构建体包含：i)编码来自所述多种肽的肽的第一核苷酸序列；以及ii)编码可切割部分的第二核苷酸序列，其中所述可切割部分的位置使得所述选自所述多种肽的肽的至少一个N
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末端氨基酸残基在所述可切割部分之前或之内；b)转录和翻译，或翻译所述多种核酸构建体；以及c)使用内切蛋白酶切割所述可切割部分，任选地，与(b)同时进行，从而从所述肽的剩余部分的切割所述肽的至少一个N
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末端氨基酸残基，其中来自所述肽的所述至少一个N
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末端氨基酸残基的切割产生所述肽文库的恰当折叠肽。34.如权利要求33所述的方法，其中所述来自多种肽的肽结合细胞受体。35.如权利要求33所述的方法，其中所述来自多种肽的肽结合T细胞受体(TCR)。36.如权利要求33
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35中任一项所述的方法，其中所述可切割部分是蛋白质。37.如权利要求33
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35中任一项所述的方法，其中所述可切割部分是SEQ ID NO.:2。38.如权利要求33
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35中任一项所述的方法，其中所述可切割部分是小泛素样修饰
(SUMO)部分。39.如权利要求33
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37中任一项所述的方法，其中，所述内切蛋白酶是肠激酶。40.如权利要求33
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37中任一项所述的方法，其中，所述内切蛋白酶是Ulp1肽酶。41.如权利要求33
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40中任一项所述的方法，其中所述至少一个N
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末端氨基酸残基是甲硫氨酸。42.如权利要求33
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41中任一项所述的方法，其中所述文库具有超过约103种、约104种、约105种、约106种、约107种、约108种、约109种、约10
10
种、约10
11
种、约10
12
种、约10
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【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：瑞佩尔托利免疫医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：