一种制备类泛素探针的多肽荧光底物方法技术

本发明专利技术提出了一种功能性多肽的合成方法。该方法包括：将粗肽的碳端氨基酸与Gly

【技术实现步骤摘要】
一种制备类泛素探针的多肽荧光底物方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及制备类泛素探针的多肽荧光底物方法。

技术介绍

[0002]Cbz-RLRGG-AMC一种多肽片段的荧光底物。它的主体由蛋白翻译后修饰-泛素C末端5个氨基酸残基Arg-Leu-Arg-Gly-Gly构成的序列。该序列的N端裸露氨基由Cbz(苄氧羰基)保护基进行选择性保护，而C端连接AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)荧光分子。该底物在遇到去泛素化水解酶，如异肽酶(IPaseT)以及其他泛素C末端水解酶(UCHs)时，能够模拟野生型泛素链在末端甘氨酸处发生酰胺键水解断裂，从而释放AMC分子显著增强其发出的荧光，这样通过荧光就能够精确测定水解效率，确定酶活。泛素Cbz-RLRGG-AMC作为去泛素化酶的荧光检测试剂，实测去泛素化水解酶的催化水解效率(Kcat/Km)能够达到95M-1s-1。基于Cbz-RLRGG-AMC的荧光特性，该多肽荧光底物被作为高通量筛选工具，被广泛用于去泛素化酶抑制剂的开发和靶向去泛素化酶的小分子和多肽药物的筛选。

技术实现思路

[0003]本专利技术提出了一种多肽的合成方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将粗肽的碳端氨基酸与Gly-AMC进行缩合反应，以便获得所述多肽，所述缩合反应是在缩合剂的活化下进行的，所述缩合剂包括选自HCTU(6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)、HOBT(1-羟基苯并三唑)、PyAOP(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)、HATU(2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和HOAT(1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)的至少之一。根据本专利技术实施例的方法，操作简便，所制备的多肽荧光底物产量大，纯度高，成本低，利于荧光试剂的商业化。
[0004]根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0005]根据本专利技术的实施例，所述缩合剂为HCTU、PyAOP或HATU和HOAT。专利技术人发现，所述缩合剂为HCTU、PyAOP或HATU和HOAT，多肽的产率进一步提高。
[0006]根据本专利技术的实施例，所述缩合剂为HATU和HOAT，所述HATU和HOAT的物质的量比为1:1。专利技术人发现，当缩合剂为HATU和HOAT的组合，且二者的物质的量比为1：1时，多肽的产率提高显著。
[0007]根据本专利技术的实施例，所述缩合剂为PyBOP、PyAOP、HCTU、HATU和HOAT或HBTU和HOBT，所述缩合反应进一步在加有DIEA(N,N-二异丙基乙胺)的条件下进行的。
[0008]根据本专利技术的实施例，所述缩合剂为HOBT，所述缩合反应进一步在加有DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)的条件下进行的。
[0009]根据本专利技术的实施例，所述粗肽是通过Fmoc固相合成法合成的。
[0010]根据本专利技术的实施例，所述粗肽具有RLRGG的氨基酸序列，所述粗肽是通过如下方
式获得的：以氯树脂作为固相载体，经缩合剂活化，将待合成粗肽按照氨基酸由C端向N端的顺序逐个偶联到氯树脂上，最后一个氨基酸用Cbz保护，经全保护切割后，获得所述粗肽。
[0011]根据本专利技术的实施例，将待合成粗肽按照氨基酸由C端向N端的顺序逐个偶联到氯树脂上是在温度为30～32℃下、HCTU活化下进行的。
[0012]根据本专利技术的实施例，利用含有20％哌啶的DMF溶液进行脱Fmoc反应。
[0013]根据本专利技术的实施例，最后一个氨基酸用Cbz保护是通过将连接有RLRGG的氯树脂在DIEA、CbzCl和DMF的混合溶液中进行的，所述混合溶液中的DIEA、CbzCl和DMF的体积比为1:1:8。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述全保护切割是通过将连接有RLRGG的氯树脂在1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇和DCM的混合溶液中进行的，所述混合溶液中的1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇和DCM体积比为1:4。
[0015]根据本专利技术的实施例，将待合成粗肽按照氨基酸由C端向N端的顺序逐个偶联到氯树脂上包括：
[0016](1)将用DMF溶解的Fmoc-Gly-OH与DIEA在30～32℃下在多肽合成管中进行第一接触，以便将Gly偶联到所述氯树脂上；
[0017](2)将偶联有Gly的氯树脂与含有20％哌啶的DMF溶液进行接触，以便脱除Fmoc；
[0018](3)将用DMF溶解的Fmoc-Arg-OH与DIEA在30～32℃下在多肽合成管中进行第二接触，所述第二接触是在HCTU活化下进行的，以便将Arg偶联到Gly的N端；
[0019](4)将偶联有Arg-Gly的氯树脂与含有20％哌啶的DMF溶液进行接触，以便脱除Fmoc；
[0020](5)将用DMF溶解的Fmoc-Leu-OH与DIEA在30～32℃下在多肽合成管中进行第三接触，所述第三接触是在HCTU活化下进行的，以便将Leu偶联到Arg的N端；
[0021](6)将偶联有Leu-Arg-Gly的氯树脂与含有20％哌啶的DMF溶液进行接触，以便脱除Fmoc；
[0022](5)将用DMF溶解的Fmoc-Arg-OH与DIEA在30～32℃下在多肽合成管中进行第四接触，所述第四接触是在HCTU活化下进行的，以便将Arg偶联到Leu的N端；
[0023](6)将偶联有Arg-Leu-Arg-Gly的氯树脂与含有20％哌啶的DMF溶液进行接触，以便脱除Fmoc。
[0024]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0025]本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0026]图1是根据本专利技术实施例的合成多肽的色谱图；
[0027]图2是根据本专利技术实施例的合成多肽的质谱图。
具体实施方式
[0028]下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考
附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0029]此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本专利技术的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0030]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种稳定性好，纯度高的多肽。
[0031]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：所述多肽的氨基酸序列如Cbz-RLRGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多肽的合成方法，其特征在于，将粗肽的碳端氨基酸与Gly-AMC进行缩合反应，以便获得所述多肽，所述缩合反应是在缩合剂的活化下进行的，所述缩合剂包括选自HCTU、HOBT、PyAOP、PyBOP、HBTU、HATU和HOAT的至少之一。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缩合剂为HCTU、PyAOP或HATU和HOAT。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缩合剂为HATU和HOAT，所述HATU和HOAT的物质的量比为1:1；任选地，所述缩合剂为PyBOP、PyAOP、HCTU、HATU和HOAT或HBTU和HOBT，所述缩合反应进一步在加有DIEA的条件下进行的；任选地，所述缩合剂为HOBT，所述缩合反应进一步在加有DIC的条件下进行的。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗肽是通过Fmoc固相合成法合成的。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述粗肽具有RLRGG的氨基酸序列，所述粗肽是通过如下方式获得的：以氯树脂作为固相载体，经缩合剂活化，将待合成粗肽按照氨基酸由C端向N端的顺序逐个偶联到氯树脂上，最后一个氨基酸用Cbz保护，经全保护切割后，获得所述粗肽。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将待合成粗肽按照氨基酸由C端向N端的顺序逐个偶联到氯树脂上是在温度为30～32℃下、HCTU活化下进行的；任选地，利用含有20％哌啶的DMF溶液进行脱Fmoc反应。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，最后一个氨基酸用Cbz保护是通过将连接有RLRGG的氯树脂在DIEA、CbzCl和DMF的混合溶液中进行的，所述混合溶液中的DIEA、Cbz...

【专利技术属性】
技术研发人员：田长麟，郑勇，吕佩，
申请(专利权)人：苏州星洲生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：