一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒。该纳米抗体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的VHH链。本发明专利技术构建了噬菌体展示纳米抗体库，通过筛选获得了人源化IgG1FC特异性的VHH，并专门比较了传统荧光抗体(山羊抗人IgG(H+L)交叉吸附二抗,Alexa Fluor 488，Thermo Fisher)和重组荧光抗体(VHH

【技术实现步骤摘要】
一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]抗免疫球蛋白G二抗是进行基础研究和医学诊断的基本工具之一。但实验过程复杂，成本效益低，难以避免外源性物质的影响，且违反动物福利原则。因此，有必要研发一种简单高效，绿色可替代性实验方案。已有研究证明，带有绿色荧光蛋白(GFP)的单链可变片段(ScFv)融合抗体可在流式细胞术或免疫荧光实验中直接标记细胞，避免因标记荧光素基团而影响抗原结合力。1993年，科学家Hamers
‑
Casterman首次报道骆驼血液中存在一种天然缺乏CH1结构域和轻链的重链抗体，即纳米抗体(Nanobody,Nb)，是己知的可结合目标抗原的最小单位。因其具有很好的结构稳定性，易于在原核表达系统中表达，以及经简单的工程改造可获得适合体外和体内应用的试剂而受到赞赏。纳米抗体在亲和力方面与scFv相当，但在可溶性、稳定性、表达产率以及DNA操作、文库构建的容易性方面超越scFv。相对于传统的IgG(150kDa)，Nb的微小尺寸和扩展的CDRH3赋予了与抗原的隐蔽表位结合的独特能力。Nb基于上述诸多优良特性，能有效地克服单克隆抗体为检测抗体的一些不足和缺陷。
[0003]因此，本研究采用噬菌体展示技术筛选特异性结合人IgG1 FC片段的纳米抗体。然后，将纳米体与绿色荧光蛋白(GFP)融合并在大肠杆菌中大规模生产。用纯化的重组荧光抗体(VHH<br/>‑
GFP)筛选高表达人IgG1单克隆抗体的CHO细胞株。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种用于筛选高表达量细胞系的纳米抗体以及方法和试剂盒，能够快速有效的筛选出亚克隆表达量高的细胞系。
[0005]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]一种抗人抗体FC片段的纳米抗体，该纳米抗体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的VHH链。
[0007]进一步地，VHH链还可以是与如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列具有80％同源性以上，且具有相同功能的氨基酸序列。
[0008]一种用于筛选高表达量细胞系的方法，包括以下步骤：
[0009](1)构建稳定表达人IgG1的细胞系；
[0010](2)对构建得到的细胞系进行培养，然后加入上述纳米抗体，继续培育以后检测thermo抗体和纳米抗体的平均荧光强度值，根据平均荧光强度值筛选出高表达量的细胞系。
[0011]进一步地，步骤(1)的具体过程为：
[0012]合成抗Her2的人源IgG1抗体对应的DNA序列，将其克隆至表达载体，然后构建重组表达质粒，最后转染CHO
‑
K1细胞即可。
[0013]进一步地，步骤(2)中对步骤(1)构建得到的细胞系进行培育的过程为：
[0014](1)取细胞系，使用PBS清洗，1000rpm离心5分钟后，去除上清，加入0.4mL含1％HAS的CD
‑
CHO细胞培养基的封闭液重悬，调整细胞密度为1
×
10
e6
/mL；
[0015](2)将步骤(1)培育得到的细胞置于37℃培养箱60分钟，每5
‑
10分钟混匀细胞一次，避免细胞贴壁，封闭后，1000rpm离心5分钟，去上清，使用150μl PBS重悬计数，调整细胞密度为2.5
×
106个/mL。
[0016]进一步地，步骤(2)中加入纳米抗体后的培育过程为：
[0017]4℃避光染色30分钟；1000rpm离心，去上清；加入2倍染色体积的预冷PBS洗涤2次，1000rpm离心去上清；再用200μl PBS重悬并去除结团细胞。
[0018]进一步地，步骤(2)中所述筛选的标准为：
[0019]筛选thermo抗体和纳米抗体平均荧光强度值分别为最高的20％的细胞进行培育，得到高表达的细胞系。
[0020]一种用于筛选高表达细胞系的试剂盒，包括上述纳米抗体。
[0021]本专利技术的有益效果：
[0022]本专利技术构建了噬菌体展示Nb库，通过筛选获得了人源化IgG1 FC特异性的VHH，并专门比较了传统荧光抗体(与人源化IgG1特异性结合)和重组荧光抗体(VHH
‑
GFP)筛选高表达人源化IgG1单克隆抗体CHO细胞系，为选择合适的荧光抗体提供了合理的基础。
[0023]本专利技术构建了一种新的抗人抗体FC片段的纳米抗体，其可用于亚克隆高表达的细胞系的筛选。
附图说明
[0024]图1为VHH
‑1‑
GFP和VHH
‑
16
‑
GFP的亲和力检测；
[0025]图2为流式细胞仪检测VHH
‑
GFP的结合活性；
[0026]图3为流式细胞术分析重组蛋白VHH
‑
GFP的亲和力荧光值；
[0027]图4为Thermo抗体和VHH
‑1‑
GFP重组抗体的F.sight染色结果；
[0028]图5为Thermo抗体和VHH
‑1‑
GFP筛选细胞时所有克隆的荧光值的分布情况；
[0029]图6为Thermo抗体和VHH
‑1‑
GFP筛选亚克隆细胞表达量。
具体实施方式
[0030]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0031]实施例1 抗原制备和羊驼免疫
[0032]1、人IgG1抗体Fc片段重组蛋白的表达制备
[0033]合成人IgG1抗体Fc片段对应的DNA序列，克隆到带分泌信号肽的真核表达载体pFcIG中，电转大肠杆菌trans5α，经过氨苄青霉素筛选，对单克隆测序获得正确的重组质粒；然后扩大培养含重组质粒的宿主菌，使用去内毒素试剂盒获得无菌无内毒素质粒；将IgG1Fc重组质粒与polyplus悬浮细胞转染试剂混合，转染HEK293F细胞，在无血清培养基中
扩大培养5天后，收集培养基上清，使用ProteinA树脂分离纯化人IgG1Fc重组蛋白。
[0034]2、羊驼(Alpaca)免疫
[0035]对2只羊驼的颈背部皮下、肌肉多点注射人IgG1Fc重组蛋白成多个包块，跟踪观察皮下注射包块的吸收情况，以确认免疫正确。首次免疫使用0.5mg抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，乳化后注射，体积1m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人抗体FC片段的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的VHH链。2.根据权利要求1所述的抗人抗体FC片段的纳米抗体，其特征在于，所述VHH链还可以是与如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列具有80％同源性以上，且具有相同功能的氨基酸序列。3.一种用于筛选高表达量细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建稳定表达人IgG1的细胞系；(2)对构建得到的细胞系进行培养，然后加入权利要求1或2所述的纳米抗体，继续培育以后检测Thermo抗体和纳米抗体的平均荧光强度值，根据平均荧光强度值筛选出高表达量的细胞系。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体过程为：合成抗Her2的人源IgG1抗体对应的DNA序列，将其克隆至表达载体，然后构建重组表达质粒，最后转染CHO
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K1细胞即可。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中对步骤(1)构建得到的细胞系进行培育的过程为：(1)取细胞系，使用PB...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱迪，刘江海，王征，
申请(专利权)人：上海宝济药业有限公司，
类型：发明
国别省市：