一种以5-羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株、构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种以5

【技术实现步骤摘要】
RNA聚合酶启动转录。
[0011]提供一种以5羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0012](1)利用PCR技术或酶切方法对载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；
[0013](2)利用特异性引物分别对5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因进行PCR扩增，回收得到目的片段；
[0014](3)利用无缝克隆方法将所述含有5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因回收片段与所述线性化载体片段进行连接、转化，得到重组表达载体；
[0015](4)将所述重组表达载体转入宿主细胞，得到工程菌株。
[0016]提供一种血清素的生物转化方法，包括以下步骤：
[0017](1)将上述任一所述的工程菌在含有抗生素的种子培养基中培养，得到种子液；
[0018](2)将所述的种子液接入到发酵培养基中，进行发酵培养；
[0019](3)发酵一定时间后添加诱导剂进行诱导表达；
[0020](4)加入底物5
‑
羟基色氨酸进行生物转化合成血清素。
[0021]按上述方案，所述抗生素为卡那霉素；
[0022]按上述方案，步骤(1)中所述种子液OD
600
＝5
‑
10；
[0023]按上述方案，步骤(1)中所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物；
[0024]按上述方案，步骤(1)中所述种子液的培养条件为28
‑
40℃，160
‑
230rpm，优选为37℃，225rpm；
[0025]按上述方案，步骤(1)中所述种子液的培养时间为10
‑
20h，优选为15h；
[0026]按上述方案，步骤(1)中所述种子液接入发酵培养基的比例为1％
‑
4％，优选比例为2％；
[0027]按上述方案，步骤(2)中所述发酵培养基(质量百分比)为1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％KH2PO4和1.64％K2HPO4·
3H2O；
[0028]按上述方案，步骤(2)中所述发酵培养基的培养条件为28
‑
40℃，160
‑
230rpm，优选为37℃，220rpm；
[0029]按上述方案，步骤(2)中所述诱导剂加入时间为发酵培养后的1
‑
5h，优选为2h；
[0030]按上述方案，步骤(2)中所述诱导剂为IPTG；
[0031]按上述方案，步骤(2)中所述IPTG的终浓度为0.1
‑
1mM，优选为0.5mM；
[0032]所述诱导表达的条件为16
‑
37℃，优选为25℃；
[0033]所述诱导表达时间为6
‑
18h，优选为16h；
[0034]按上述方案，步骤(3)中诱导至一定时间后，加入细胞通透剂处理。5
‑
羟基色氨酸较难进入细胞，导致大量的底物不能得到有效利用，本专利技术通过细胞通透剂的使用可达到提高底物利用率，并提高产量的目的。
[0035]按上述方案，所述细胞通透剂为多粘菌素B、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和溶菌酶中的一种或多种；细胞通透剂的浓度为5
‑
50μg/mL。
[0036]按上述方案，所述底物为5
‑
羟基色氨酸，所述底物浓度为10
‑
40g/L，优选为30
‑
NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述引物序列如下：
[0056]引物序列5'
→
3'P1TTAATAAGGAGATATACCATGGAAGCGGGCGATTTTAAAGAP2TTCTGTTCGACTTAAGCATTACGGTTTGTTGTTTTTAAAGGTTTTCAGCP3TTAATAAGGAGATATACCATGAACACCAGCGAATTTCGCCGP4TTCTGTTCGACTTAAGCATTAGCGTTCCGCGCGCP5TTAATAAGGAGATATACCATGGATGCGGCGGAATTTCGCCGCCGP6TTCTGTTCGACTTAAGCATTAGCAGGTAATGCCCACCACGP7TTAATAAGGAGATATACCATGGAAGCGAACCAGTTTAAAGATTTTGCP8TTCTGTTCGACTTAAGCATTATTTTTTCAGCACTTCATCCGCCGP9TTAATAAGGAGATATACCATGGATGCGGAAGAATTTCGCCGP10TTCTGTTCGACTTAAGCATTATTTTTTTTCATCGCTAATTTTTTTGGTCAGTTCC
[0057](3)上述PCR扩增程序为95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环，72℃延伸10min。
[0058](4)将上述目的片段与性化载体pRSFDuet
‑
1连接，得到重组质粒，将其命名为pRSFDuet1
‑
GmDDC、pRSFDuet1
‑
PaDDC、pRSFDuet1
‑
CcDDC、pRSFDuet1
‑
TcDDC和pRSFDuet1
‑
CgDDC，经测序验证正确，获得成功构建的5种重组质粒。
[0059](5)利用电转法将pRSFDuet1
‑
GmDDC、pRSFDuet1
‑
PaDDC、pRSFDuet1
‑
CcDDC、pRSFDuet1
‑
TcDDC和pRSFDuet1
‑
CgDDC质粒转化到大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)中，并涂布到含有卡那霉素的LB固体培养基上，LB平板在37℃培养至长出转化子，挑取阳性转化子，分别获得预期工程菌1、工程菌2、工程菌3、工程菌4和工程菌5。
[0060]实施例2细胞发酵产血清素
[0061](1)将工程菌1、工程菌2、工程菌3、工程菌4和工程菌5在含有50μg/mL卡那霉素的种子培养基中过夜培养，得到种子液，所述种子培养基(质量百分比)为1％胰蛋白胨、1％氯化钠和0.5％酵母提取物，所述种子液的培养条件为37℃，225rpm；
[0062](2)将上述种子液按2％接种到含有1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、0.5％甘油、0.231％KH2PO4和1.64％K2HPO4·
3H2O的发酵培养基(质量百分比)中进行发酵培养；
[0063](3)发酵培养2h后，加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导表达，诱导表达的温度为25℃，诱导时间为16h；加入40g/L的底物5
‑
羟基色氨酸，进行生物转化阶段本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.以5
‑
羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株，其特征在于：含有5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因，能够过表达生成5
‑
羟色氨酸脱羧酶，所述5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因为GmDDC、PaDDC、CcDDC、TcDDC或CgDDC，所述GmDDC、PaDDC、CcDDC、TcDDC和CgDDC的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于：所述5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因GmDDC、PaDDC、CcDDC、TcDDC或CgDDC对应编码的5
‑
羟色氨酸脱羧酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。3.如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的5
‑
羟色氨酸脱羧酶在以5羟基色氨酸为底物微生物合成血清素中的应用。4.权利要求1所述的工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)利用PCR技术或酶切方法对载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；(2)利用特异性引物分别对5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因进行PCR扩增，回收得到目的片段；(3)利用无缝克隆方法将所述含有5
‑
羟色氨酸脱羧酶基因回收片段与所述线性化载体片段进行连接、转化，得到重组表达载体；(4)将所述重组表达载体转入宿主细胞，得到工程菌株。5.一种血清素的生物转化方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将上述权...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云现，冯斌，杨志彬，崔金旺，田昊博，胡江林，田俊波，蒋硕生，刘婵，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：