一种高产透明质酸的重组菌及其应用，其特征在于，是将心磷脂合成途径中的心磷脂合酶基因转入至原始菌株，并失活了转录调控因子IolR，和/或转入透明颤菌血红蛋白基因制备而成。本发明专利技术通过强化透明质酸合成酶的“激活因子”—心磷脂的合成从而提高透明质酸的产量，并进一步失活转录调控因子IolR和/或引入透明颤菌血红蛋白基因来增强效果。优选的重组菌与出发菌株相比，透明质酸摇瓶产量可提高2.15倍，在透明质酸的生产中具有良好的工业应用前景。景。景。
【技术实现步骤摘要】
Engineering,2018,47:401
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413.)。还有研究人员公开了敲除透明质酸竞争途径中的Cg0420、Cg0424基因使谷氨酸棒杆菌生产透明质酸的产量提高14.9％，摇瓶产量达到6.4g/L(Wang Y,Hu L,Huang H,et al.Eliminating the capsule
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like layer to promote glucose uptake for hyaluronan production by engineered Corynebacterium glutamicum[J].Nature Communications,2020,11(1):1
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10.)。进一步的，该期刊文献还报道了通过外源添加透明质酸酶将透明质酸生产和降解偶联，发酵罐产量可达74.1g/L，此时其产品为超低分子量透明质酸(分子量区间：51
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56kDa)。专利文献CN110305827A和研究论文则公开了通过强化透明质酸合成途径的同时弱化竞争途径构建重组谷氨酸棒杆菌，其发酵罐产量高达28.7g/L，分子量为300
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500kDa(Cheng F,Yu H,Stephanopoulos G.Engineering Corynebacterium glutamicum for high
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titer biosynthesis of hyaluronic acid[J].Metabolic Engineering,2019,55:276
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289.)。
[0005]除了通过调控代谢路径来强化透明质酸的合成外，提高透明质酸合成酶的活力对提高透明质酸的产量也至关重要。为此，研究人员对透明质酸合成酶的催化机理及突变改造进行了一系列研究。研究人员通过对来源于Pasteurella multocida的透明质酸合成酶(pmHAS)进行定向进化，在无细胞体系中合成了分子量为4.7MDa的透明质酸(Mandawe J,Infanzon B,Eisele A,et al.Directed Evolution of Hyaluronic Acid Synthase from Pasteurella multocida towards High
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Molecular
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Weight Hyaluronic Acid[J].ChemBioChem,2018,19(13):1414
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1423.)。Garima Agarwal等对来源于Streptococcal的透明质酸合成酶(seHAS)进行了同源建模，预测了活性口袋中重要氨基酸，并通过实验进行了验证(Agarwal G,Krishnan K V,Prasad S B,et al.Biosynthesis of Hyaluronic acid polymer:Dissecting the role of sub structural elements of hyaluronan synthase[J].Scientific reports,2019,9(1):1
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12.)。此外，研究人员还通过突变seHAS C末端414
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417位氨基酸，确定了C末端在透明质酸分子聚合以及分子量调控中起到关键作用。本专利技术创造性地提出，从透明质酸合成酶这一膜蛋白在细胞膜上保持正常构象所需要的辅助因子——心磷脂分子的合成途径强化出发，进行透明质酸生产菌株的改造，并取得了显著的产量提升效果。到目前为止，通过强化心磷脂合成来提高透明质酸产量还未见报道。
技术实现思路
[0006]心磷脂分子是保障透明质酸合成酶在细胞膜上正确组装的辅助因子：每分子的透明质酸合成酶需结合约16分子的心磷脂分子才能保持生物学活性。因此，转入心磷脂合成相关基因能够促进谷氨酸棒杆菌合成心磷脂，从而维持透明质酸合成酶的活性。此外，谷氨酸棒杆菌中的转录调控因子IolR会抑制转运蛋白IolT1/IolT2对葡萄糖的转运过程，同时会抑制激酶对葡萄糖的磷酸化过程，不利于底物吸收利用。敲除转录调控因子基因能够解除IolR对葡萄糖转运及磷酸化的抑制。转入透明颤菌血红蛋白基因能够促进谷氨酸棒杆菌主动摄取培养基中的氧气，促进产物合成。本专利的核心一方面在于在重组菌株中通过高表达心磷脂合酶来强化心磷脂合成；进一步地，结合敲除IolR，促进底物吸收利用，或结合转入透明颤菌血红蛋白基因，促进重组菌摄取氧气。相比于出发菌株，以上单个或两个、三个组合策略均能提高重组谷氨酸棒杆菌异源合成透明质酸的产量。
[0007]一方面，本申请提供了一种高产透明质酸的重组菌，其特征在于，是将心磷脂合成途径中的心磷脂合酶基因、磷脂酰甘油磷酸合酶基因中的一种或一种以上转化至原始菌株构建而成。
[0008]进一步地，所述重组菌中转入心磷脂合酶基因。
[0009]进一步地，心磷脂合酶基因、磷脂酰甘油磷酸合酶基因来源于但不限于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等菌种。
[0010]进一步地，所述原始菌株为谷氨酸棒杆菌，优选为ATCC 13032的谷氨酸棒杆菌。
[0011]进一步地，所述原始菌株为中国专利申请号ZL201910495504.8中的C.glu
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Δldh/AB、C.glu
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Δldh/A
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PdapB
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B、C.glu
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Δldh/A
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PdapB
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B
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aF或者C.glu
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Δldh
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aEG/A
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PdapB
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B
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aF
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aE。
[0012]进一步地，所述心磷脂合酶蛋白序列为SEQ ID NO.1。
[0013]进一步地，所述心磷脂合酶蛋白序列也包括在SEQ ID NO.1基础上对其酶活进行突变改造的单点或多点突变所获得的突变体。
[0014]进一步地，上述突变体为将377位谷氨酰胺突变为赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等；优选地，第377位谷氨酰胺突变为天冬酰胺。
[0015]进一步地，上述突变体为将459位谷氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酰胺；优选地，第459位谷氨酸突变为天冬氨酸。
[0016]进一步地，上述突变体为将472位赖氨酸突变为苏氨酸、精氨酸、异亮氨酸；优选地，第472位赖氨酸突变为精氨酸。
[0017]本申请中所述的突变体可以通过对蛋白序列为SEQ ID NO.1的心磷脂合酶进行突变改造获得；突变改造所用的预测方法、操作方法、验证方法可以为本领域中已知或研究中的，本领域技术人员认为可用的方法；本申请中的突变体保持有心磷脂合酶的活性。
[0018]进一步地，所述重组菌中失活了转录调控因子IolR，和/或转入透明颤菌血红蛋白基因。
[本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高产透明质酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将心磷脂合成途径中的心磷脂合酶基因、磷脂酰甘油磷酸合酶基因中的一种或一种以上转化至原始菌株构建而成。2.根据权利要求1所述的重组菌，其中所述重组菌中转入心磷脂合酶基因。3.根据权利要求1或2的重组菌，其中所述心磷脂合酶基因、磷脂酰甘油磷酸合酶基因来源于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或铜绿假单胞菌。4.根据权利要求1
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3任一项所述的重组菌，其中所述原始菌株为谷氨酸棒杆菌，优选为ATCC 13032的谷氨酸棒杆菌。5.根据权利要求1
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3任一项所述的重组菌，其中所述原始菌株为中国专利申请号ZL201910495504.8中的C.glu
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Δldh/AB、C.glu
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Δldh/A
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PdapB
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B、C.glu
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Δldh/A
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PdapB
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B
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aF或者C.glu
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Δldh
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aEG/A
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PdapB
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B
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aF
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aE。6.根据权利要求1
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5任一项所述的重组菌，其中所述心磷脂合酶蛋白序列为SEQ ID NO.1。7.根据权利要求1
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5任一项所述的重组菌，其中所述心磷脂合酶蛋白序列为在SEQ ID NO.1基础上进行突变改造获得的单点或多点突变体。8.根据权利要求1
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7任一项所述的重组菌，其中进一步地...
【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，王苗苗，杜岩，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
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