一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种α

【技术实现步骤摘要】
一种
α
‑
氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是指一种α
‑
氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用。

技术介绍

[0002]丙谷二肽(L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺，Ala
‑
Gln)因其热稳定性和高溶解度，在人体内能够水解产生L
‑
Gln，发挥药理作用，在临床上被广泛用作L
‑
Gln的替代品。目前，合成丙谷二肽主要采用化学合成法、化学酶合成法和生物酶合成法。其中化学法合成丙谷二肽涉及有毒试剂、反应步骤复杂、伴随多种副产物等问题，化学酶法存在生产效率低等问题，不利于工业化生产应用。而生物酶法合成丙谷二肽因其绿色、高效、安全等特点具有良好的应用前景。
[0003]生物酶法中合成丙谷二肽活性最高的酶是Hirao等发现来源于Sphingobacterium siyangensis的α
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氨基酸酯酰基转移酶(α
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amino acid ester acyltransferase，SAET)，该酶催化L
‑
Gln和L
‑
丙氨酸甲酯为底物，直接合成丙谷二肽。SAET具有保守基序(GxSYxG，其中x为非保守氨基酸)，属于一种丝氨酸酶，其信号肽为前20个氨基酸，利于SAET的正确折叠并转运至周质空间发挥催化功能。而大肠杆菌胞内含有二肽降解相关酶包括氨基肽酶A、B、D、N等，同时周质空间内含有周质二肽转运蛋白体DppABCDEF，从而摄取并降解二肽底物。因此利用全细胞合成丙谷二肽时，易造成产物降解。
[0004]目前丙谷二肽转化率和生产效率有待进一步提高，这对于生物酶法合成丙谷二肽的产业化具有现实意义。传统的固定化酶技术便于反应后分离底物和产物，易于回收酶和重复利用，可批量连续操作。但对于胞内酶的固定化，首先需要进行酶的分离纯化操作，但该过程大大损伤酶的生物活性，也增加了工业化生产的步骤和成本。

技术实现思路

[0005]为了解决使用全细胞进行生物酶法催化合成丙谷二肽时，底物L
‑
Gln和L
‑
丙氨酸甲酯盐酸盐需要进入细胞周质空间，在酶的催化作用下，生成丙谷二肽，转化率仍较低，有待进一步提高；另外使用经分离纯化处理过的酶液生产成本高、操作步骤复杂，不利于其产业化应用。
[0006]为了解决胞内酶能够回收重复利用，同时避免胞内酶的分离纯化操作，并且减少大肠杆菌肽酶等对二肽等产物的降解问题，因此采用细胞表面展示技术，将目标酶定位在细胞表面，在胞外即可催化L
‑
Gln和L
‑
丙氨酸甲酯一步合成丙谷二肽，从而提高底物转化率，并且仅需收集菌体即可重复使用、操作简单、生产成本低，本专利技术提供了一种α
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氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用。
[0007]一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是通过将SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达得到。
[0008]在本专利技术的一个实施例中，所述SAET蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]在本专利技术的一个实施例中，所述外膜蛋白OmpA为外膜蛋白OmpA的第1
‑
159个氨基酸片段。
[0010]在本专利技术的一个实施例中，所述外膜蛋白OmpA的第1
‑
159个氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]一种所述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
[0012](1)以pET30a质粒、pACYCDuet
‑
1质粒或pET21a质粒为载体，将SAET蛋白基因构建至载体上，得到表达载体1；
[0013](2)将外膜蛋白OmpA的基因构建至表达载体1上SAET蛋白基因的上游，得到表达载体2；
[0014](3)将步骤(2)中所得表达载体2转化到宿主菌中，筛选SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达的重组菌，即为所述重组大肠杆菌。
[0015]在本专利技术的一个实施例中，所述SAET蛋白和外膜蛋白OmpA以T7启动子、BAD启动子或rhaPBAD启动子进行启动表达。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，所述大肠杆菌选自DH5α、JM109或BL21菌株。
[0017]本专利技术还提供了所述的重组大肠杆菌在催化合成丙谷二肽中的应用。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，所述催化合成丙谷二肽包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌的重悬液与含谷氨酰胺底物溶液混合，在20
‑
35℃中反应20
‑
50min。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，所述催化合成丙谷二肽包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌的重悬液与含谷氨酰胺底物溶液混合在27℃反应40min。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，所述含谷氨酰胺底物溶液为谷氨酰胺与丙氨酸甲酯盐酸盐混合得到的混合溶液，pH值为7.0
‑
9.5。
[0021]在本专利技术的一个实施例中，所述含谷氨酰胺底物溶液为谷氨酰胺与丙氨酸甲酯盐酸盐混合得到的混合溶液的pH值为8.5。
[0022]本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0023]为了解决胞内酶能够回收重复利用，同时避免胞内酶的分离纯化操作，并且减少大肠杆菌肽酶等对二肽等产物的降解问题，因此采用细胞表面展示技术，将目标酶定位在细胞表面，在胞外即可催化L
‑
Gln和L
‑
丙氨酸甲酯一步合成丙谷二肽，从而提高底物转化率，并且仅需收集菌体即可重复使用、操作简单、生产成本低。
附图说明
[0024]为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中
[0025]图1是本专利技术pACYCDuet
‑
P
BAD
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saet表达质粒图谱；
[0026]图2是本专利技术pACYCDuet
‑
P
BAD
‑
ompA
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saet表达质粒图谱；
[0027]图3是本专利技术大肠杆菌SAET表面展示系统的示意图；
[0028]图4是本专利技术使用HPLC在波长为338nm处检测丙谷二肽标准品的出峰图谱；
[0029]图5是本专利技术使用HPLC测定绘制丙谷二肽浓度的标准曲线；
[0030]图6是本专利技术pACYCDuet
‑
P
BAD
‑
ompA
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saet菌株在不同诱导条件下表达的SAET催化合成丙谷二肽的浓度；
[0031]图7是本专利技术在相同条件下，pACYCDuet...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是通过将SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达得到。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述SAET蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述外膜蛋白OmpA为外膜蛋白OmpA的第1
‑
159个氨基酸片段。4.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述外膜蛋白OmpA的第1
‑
159个氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。5.一种权利要求1
‑
4中所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pET30a质粒、pACYCDuet
‑
1质粒或pET21a质粒为载体，将SAET蛋白基因构建至载体上，得到表达载体1；(2)将外膜蛋白OmpA的基因构建至表达载体1上SAET蛋白基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国强，陈坚，堵国成，李江华，周景文，陈帅丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：