制备磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）融合物的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了一种融合蛋白，其包含以任意顺序的任选的信号肽、血清白蛋白、任选的连接子、磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）和任选的纯化或可检测标志物，或基本上由其组成，或由其组成。还公开了相关的多核苷酸、载体、宿主细胞、药物组合物和试剂盒。进一步提供了用于递送融合蛋白给对象、治疗癌症或肿瘤、和/或产生融合蛋白的方法。融合蛋白的方法。融合蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）融合物的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用本申请根据35 U.S.C. 119(e) 要求 2019 年 4 月 12 日提交的美国临时申请号 62/833,251的优先权，其内容通过引用在此并入本专利技术公开中。


[0002]本公开内容涉及新的肿瘤抑制融合蛋白和制造这些蛋白的方法。

技术介绍

[0003]磷酸酶与张力蛋白同源物（Phosphatase and Tensin homolog，PTEN）肿瘤抑制因子鉴定于 1997 年。PTEN 是一种蛋白磷酸酶，其关键任务是下调 pi3K/AKT 激酶途径的活性，该途径在癌症中非常频繁地过度激活。因此，PTEN 在原发癌、转移瘤、癌症干细胞和/或循环肿瘤细胞、几乎所有实体癌、淋巴瘤和白血病以及所有癌症病例的约 25%的水平上被灭活。癌症患者可能会完全丧失 PTEN 蛋白（“PTEN 无效”）或具有与细胞中残留的任何正常 PTEN 形成同源或异源二聚体的突变的促癌 PTEN 蛋白。 PTEN 缺陷能够通过 PTEN 基因的转染或病毒感染或蛋白质的脂质体包封绕过细胞膜来纠正。细胞内部活性 PTEN 的释放导致细胞和异种移植肿瘤的强烈抗癌反应（例如，生长抑制或死亡），伴随有pi3K 通路药效（pharmacodynamic，PD）生物标志物（例如，AKT、pPRAS40、pS6K）的下调。然而，这两种方法都没有任何治疗或商业适用性，此类专利和临床试验的缺乏就证明了这一点。因此，需要制备可溶形式且大量的PTEN以治疗癌症和其他疾病。本专利技术公开满足了这种需要并且还提供了相关的优点。

技术实现思路

[0004]本文公开了组合物，其包含与血清白蛋白（例如人血清白蛋白）的连续氨基酸融合的PTEN（其在本文中也称为PTEN肿瘤抑制因子，例如PTEN
‑
L和/或人PTEN）的连续氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。还公开了组合物，其包含与人血清白蛋白的连续氨基酸融合的PTEN肿瘤抑制因子的连续氨基酸，或基本上由其组成，或由其组成。还公开了制造该组合物的方法。
[0005]因此，在一方面，本文公开提供了一种融合蛋白，其包含人血清白蛋白（HSA）和人PTEN
‑
L或PTEN肿瘤抑制因子的连续氨基酸序列，或基本上由其组成，或由其组成。在一方面，血清白蛋白的氨基酸序列直接或间接与PTEN的N
‑
末端结合。在另一方面，血清白蛋白的氨基酸序列直接或间接与PTEN的C
‑
末端结合。
[0006]在一方面，PTEN选自：人PTEN、猿猴PTEN、大鼠PTEN或鼠PTEN或其各自的片段、类似物、变体、突变体、同种型或等效物。在一个实施方案中，PTEN是人PTEN或其片段、类似物、变体、突变体或等效物。在另一个实施方案中，PTEN是鼠（即小鼠）PTEN或其片段、类似物、变体、突变体或等效物。另外地或可选地，PTEN是PTEN
‑
Long（PTEN
‑
L）或其片段、类似物、变体、突变体或等效物。在另一个实施方案中，PTEN
‑
L是人PTEN
‑
L，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸
序列或其等效物，或基本上由其组成，或由其组成。另外地或可选地，PTEN
‑
L是由以下的工程化多核苷酸序列序列编码的人PTEN
‑
L：SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:171的核苷酸(nt)64
‑
nt 1728、或编码与SEQ ID NO:171或SEQ ID NO:171的核苷酸(nt)64
‑
nt 1728编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列。在另一个实施方案中，PTEN是PTEN
‑
M同种型，或其片段、类似物、变体、突变体或等效物。PTEN
‑
M是具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的人PTEN
‑
M。另外地或可选地，PTEN
‑
M是由以下的工程化多核苷酸序列序列编码的人PTEN
‑
M：SEQ ID NO:198、或编码与SEQ ID NO:6相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列。在又一个实施方案中，PTEN是PTEN
‑
N同种型或其片段、类似物、变体、突变体或等效物，任选地其中PTEN
‑
N是具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的人PTEN
‑
N，和/或任选地其中PTEN
‑
N是由以下的工程化多核苷酸序列序列编码的人PTEN
‑
N：SEQ ID NO:199、或编码与SEQ ID NO:7相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列。在进一步的实施方案中，PTEN是PTEN
‑
O同种型，或其片段、类似物、变体、突变体或等效物。PTEN
‑
O是具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的人PTEN
‑
O。另外地或可选地，PTEN
‑
O是由以下的工程化多核苷酸序列编码的人PTEN
‑
O：SEQ ID NO:200、或编码与SEQ ID NO:8相同的氨基酸序列的与其至少90%相同的序列。在进一步的实施方案中，PTEN是PTEN
‑
S同种型，或其片段、类似物、变体、突变体或等效物。PTEN
‑
S是具有SEQ ID NO:2或其等效物的氨基酸序列的人PTEN
‑
S。另外地或可选地，PTEN
‑
S是由以下的工程化多核苷酸序列序列编码的人PTEN
‑
S：SEQ ID NO:172 ，或编码与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列的与其至少90%相同的序列。在又一个实施方案中，PTEN包含最小PTEN
‑
S，或其片段、类似物、变体、突变体或等效物。最小PTEN
‑
S 包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列。另外地或可选地，最小PTEN
‑
S包含由以下的工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO:197，或编码与SEQ ID NO:162相同的氨基酸序列的与其至少90%相同的序列。
[0007]在一方面，PTEN包含SEQ ID NO:1的氨基酸174至576和以下中的一个或多个：SEQ ID NO:1的氨基酸22
‑
27；SEQ ID NO:1的氨基酸44
‑
59；SEQ ID NO:1的氨基酸43
‑
79；SEQ ID NO:1的氨基酸80
‑
120；SEQ ID NO:1的氨基酸121
‑
173；和/或 SEQ ID NO:1的氨基酸151
‑
173。在一个实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种融合蛋白，其包含血清白蛋白（SA）和磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）肿瘤抑制因子的连续氨基酸序列，任选地其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白 （HSA），并且任选地其中所述 PTEN 选自人 PTEN、猿猴PTEN、大鼠 PTEN 或鼠 PTEN。2.一种融合蛋白，其包含人血清白蛋白（HSA）和人磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN或PTEN
‑
L）肿瘤抑制因子的连续氨基酸序列，其中所述HSA在PTEN或PTEN
‑
L的上游或下游。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述血清白蛋白包含SEQ ID NO:163或13的氨基酸和SEQ ID NO:2或3的氨基酸的PTEN。4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含由选自以下的工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO: 68、59、58、157、159、65或136或其片段，或分别编码与SEQ ID NO: 68、59、58、157、159、65或136编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的融合蛋白，其具有选自SEQ ID NO: 28、19、18、129、131、25或50、或其每一个的片段、类似物、变体或等效物的氨基酸序列。6.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其具有SEQ ID NO: 14
‑
17、20
‑
27、29
‑
30、34
‑
37、49
‑
50、109
‑
132、或每一个的片段、类似物、变体或等效物、或每一个的突变体的氨基酸序列中的任一个，并且所述融合蛋白任选地进一步包含一个或多个突变，该突变的所选择的位置等效于以下中的任何一个或多个：SEQ ID NO:1 的S65、S85、S89、S91、S94、S111、S115、S117、S129、S134、T140、S161、S163、S164 和 S168 和/或 SEQ ID NO:2 的 S170、N292、S355、S360、S366 和 S370，任选地突变为天冬氨酸或谷氨酸，并且任选地其中所述蛋白被糖基化，进一步任选地其中所述蛋白的丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）残基中的一个或多个被O
‑
糖基化，并且还进一步任选地其中所述蛋白的天冬酰胺（N）残基中的一个或多个被 N
‑
糖基化。7.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其具有由选自以下的工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO: 54
‑
70、74
‑
77、135
‑
160或其片段，或分别编码与SEQ ID NO: 54
‑
70、74
‑
77、135
‑
160编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的与其至少90%相同的序列。8.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述血清白蛋白的氨基酸序列与所述PTEN的N
‑
末端或C
‑
末端直接或间接结合。9.根据权利要求1、2和8中任一项所述的融合蛋白，其中所述PTEN包含以下中的任何一种或多种：（i）成熟的人 PTEN
‑
L 独特结构域（LUD）或其片段、类似物、变体、突变体或等效物，任选地其中该 LUD 包含SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，进一步任选地其中该LUD包含由以下工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SED ID NO: 193，或编码与SED ID NO: 5相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列，任选地其中该 LUD 被糖基化，进一步任选地其中该LUD的丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）残基中的一个或多个被O
‑
糖基化；（ii）人 PTEN
‑
M 独特结构域（MUD）或其片段、类似物、变体、突变体或等效物，任选地其中该 MUD 包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列，和/或进一步任选地其中该MUD包含由以下工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO: 194，或编码与SED ID NO: 9相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列，任选其中该MUD被糖基化，进一步任选地其中该MUD的丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）残基中的一个或多个被O
‑
糖基化；
（iii）人 PTEN
‑
N 独特结构域（NUD）或其片段、类似物、变体、突变体或等效物，任选其中该 NUD 包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，和/或进一步任选地其中该NUD包含由以下工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO: 195，或编码与SED ID NO: 10相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列，任选地其中该NUD被糖基化，进一步任选地其中该NUD的丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）残基中的一个或多个被O
‑
糖基化；（iv）人 PTEN
‑
O 独特结构域（OUD）或其片段、类似物、变体、突变体或等效物，任选地其中该 OUD 包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列，和/或进一步任选地其中该OUD包含由以下工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO: 196，或编码与SED ID NO: 11相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列，任选地其中该OUD被糖基化，进一步任选地其中该OUD的丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）残基中的一个或多个被O
‑
糖基化；（v）最小细胞穿透结构域（MCPD），其包含 6 x Arg（SEQ ID NO: 39）的氨基酸序列，并且任选地其中所述融合蛋白包含在PTEN 和白蛋白之间的可切割连接子；（vi）膜结合结构域（MBD），任选地其中该 MBD 包含SEQ ID NO: 40的氨基酸序列；（vii）最小 PTEN
‑
S或其片段、类似物、变体、突变体或等效物，任选地其中该最小 PTEN
‑
S 包含SEQ ID NO: 162的氨基酸序列，和/或进一步任选地其中该最小PTEN
‑
S 包含由以下工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO: 197 ，或编码与SED ID NO: 162相同的氨基酸序列的与其至少 90%相同的序列；和（viii）PTEN
‑
S或其片段、类似物、变体、突变体或等效物，任选地其中该PTEN
‑
S包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，和/或进一步任选地其中该PTEN
‑
S包含由以下工程化多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO: 172，或编码与SED ID NO: 2相同的氨基酸序列的与其至少 90% 相同的序列。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的融合蛋白，其还包含以下中的一种或多种：信号肽（并且任选地其中所述信号肽包含人血清白蛋白信号肽），所述白蛋白和所述PTEN之间的第一连接子，在信号肽的C
‑
末端的第二连接子和在融合蛋白的N
‑
末端的第三连接子，并且任选地其中所述连接子中的一个或多个是可切割的、可检测的标志物或纯化标志物。11.一种载体，其包含编码权利要求1
‑
10中任一项所述的融...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿萨纳西奥斯，
申请(专利权)人：治疗生物科学公司，
类型：发明
国别省市：