一种细胞膜穿透肽RfA1-3L2M及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种细胞膜穿透肽RfA1

【技术实现步骤摘要】
一种细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M及其应用。

技术介绍

[0002]后基因组时代，生物技术蓬勃发展，生物分子的功能被不断解析，应用被不断拓展。例如，生物制药就是一个备受关注的领域，如基因治疗、磷酯类药物以及蛋白质类药物等。蛋白质、多肽、核酸等生物活性分子有望为精准治疗药物的开发提供技术途径与物质支撑。随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。
[0003]然而，与传统药物不同的是，生物体内环境异常复杂。例如，蛋白质、多肽、核酸等生物活性分子通过血液循环系统进行循环转运的过程中，极易发生降解、沉降、表面包埋等，大大降低了有效剂量，这些治疗分子在体内稳定性低，需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的推广应用；能够成功到达靶点位置的药物分子，如果不能有效地穿透细胞膜所构成的屏障并顺利进入细胞，同样也会限制药物分子的治疗效果。所以，开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞，且经济、安全的载体系统是亟需解决的问题。
[0004]近年来，随着分子仿生学的兴起，基于对生物的结构和功能的模拟，类病毒药、微胶囊、脂质体、聚合物胶束等药物传递系统被开发出来。它们能够对货物分子进行有效的包覆和保护，防止其在体内转运过程中的降解、丢失，而且能够协助货物分子对特定细胞进行靶标，提高功能特异性，最后，还能够克服细胞膜的电位、亲疏水等限制，提高货物分子进入细胞的效率。
[0005]在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜转运至细胞内技术的基础研究取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研究相继发现了一类蛋白结构域，如：HIV
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1Tat(48
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60)、VP22(267
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300)以及果蝇蛋白ANTP(43
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58)等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿透肽(cell
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penetrating peptides，CPP)、穿膜肽或蛋白转导域(protein transductiondomains，PTDs)。1988年Green和Frankel等首次发现TAT
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人免疫缺陷病毒(HIV)的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白第48
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60位氨基酸残基(YGRKKRRQRRR)形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相继发现了多个源自病毒或其它生物的CPP，如I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1，HSV
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1)蛋白的VP22、果蝇同源触角蛋白(drosophila hemeoprotein antennapedia transcriptionprotein，ANTP)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的前S抗原等。依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类：一类为如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原来源于病毒的短肽等；另一类为根据天然CPP的特点人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP
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1、MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPP能在体外或体内作为载药多肽，
介导一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPP因其本身具有低毒、副作用小、不干扰所携带大分子生物活性等特点，被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子，尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPP研究在基础生物学和应用研究上都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景。
[0006]从以上研究可以看到，在各式各样的分子仿生体系中，对细胞膜穿透肽的研究和应用备受关注。细胞膜穿透肽首先在病毒感染特性的研究中得以发现，包括HIV转录调节蛋白、单纯疱疹病毒VP22、乙型肝炎病毒前S抗原等。细胞膜穿透肽的最显著特性即为富含阳离子，能够与带负电荷的细胞膜结合，并且具备穿膜功能。显而易见的，若将穿膜肽应用于分子货物的运输，可以有效克服细胞膜的电荷屏障，并且促进货物分子的跨膜运输。
[0007]近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米颗粒等，但存在着潜在安全隐患，如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作、难于应用到个体等缺点。因为基于病毒穿膜肽开发的分子转运系统带有先天性的缺陷，考虑到病毒的安全隐患，其应用于临床研究不得不慎之又慎，另外，基于病毒蛋白、多肽的分子传送体系有可能引起强烈的免疫反应、病理反应。
[0008]由此可见，针对临床治疗需求及安全生物应用，非病毒类穿膜肽的获取对于安全的、新型递送体系而言非常必要。

技术实现思路

[0009]针对基于病毒穿膜肽开发的分子转运系统带有先天性的缺陷，本专利技术提供了一种细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M及其应用，所述的细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M是一种非病毒类的、新型的细胞膜穿透肽，所述的应用是一种非病毒类细胞膜穿透肽携带货物分子进入细胞的应用方法。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]一种细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M，来源于乌贼虹细胞的膜上蛋白(Doryteuthis opalescens)
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反光蛋白A1(Reflectin A1，以下简称RfA1)；
[0012]所述的细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M，是指在多种分子(蛋白、核酸、多肽等)跨膜载体体系中，在目的蛋白的伯胺端或C端进行偶联后，利用RfA1
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3L2M的自组装性能对货物分子进行包封，并利用RfA1
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3L2M的跨膜能力实现分子运输的肽；凭借RfA1
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3L2M的自组装性能，可对货物分子进行有效的装载，并降低运输过程中的降解、损耗；利用RfA1
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3L2M的细胞膜穿透性，可实现货物分子的高效转运。
[0013]所述的RfA1是一种来源于乌贼细胞的膜相关蛋白，是最初分离、鉴定自海洋生物枪乌贼虹细胞内的一种蛋白；本专利技术研究发现，该蛋白在生理条件下以及细胞内显著的自组装能力，能够实现分子的大规模聚集，且该种蛋白具备显著的、与细胞膜的相互作用，能够结合并穿透细胞膜，实现胞外分子的向内运输，实现货物分子的跨细胞膜运动。
[0014]本专利技术首先将本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M，其特征在于：来源于乌贼虹细胞的膜上蛋白
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反光蛋白A1，以下简称RfA1；RfA1呈现出显著的嵌段共聚物特性，即由生理条件下带负电的、不保守的Linkers，以下简称为L，以及生理条件下带正电的、保守的Motifs，以下简称M，组成；利用RfA1氨基酸序列中的第一、二、三段的L以及第一、二段的M，得到了细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M，氨基酸序列是：MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGVMEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDPRYYDYYGRMHDHDRYYGRSMFNQGHSMDSQRYGGWMDNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERWMDMSGYQMDMQGRWMDNYGRYVNPFNHHMYGRNMCYPYGNHYYNRHMEHPERYMDMSGYQMDMQGRWMDTHGRHCNPFGQMWHNRHGYYPGHPHGRNMFQPERWMDMSGYQMDMQGRWMDNYGRYVNPFSHNYGRHMNYPGGHYNYHHGRYMNHPERHMDMSSYQMDMHGRWMDNQGRYIDNFDRNYYDYHMY；其中：L的氨基酸序列是：MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGV；M的氨基酸序列是：MEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDP。2.权利要求1所述的一种细胞膜穿透肽RfA1
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3L2M的制备方法，其特征在于：采用化学合成或原核、真核多种获取手段对RfA...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋俊祎，胡碧茹，叶宗煌，曾玲，李保山，刘梁程，唐佳文，
申请(专利权)人：中国人民解放军国防科技大学，
类型：发明
国别省市：