重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME-N、制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME

【技术实现步骤摘要】
重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，尤其涉及一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]Gasdermin（GSDM）家族是一大类含有保守的gasdermin
‑
N结构域的焦孔素蛋白，主要成员包括GSDME、GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD和Pejvakin（PJVK）等。目前研究发现，Gasdermin 家族成员在介导细胞焦亡、炎症反应等过程中发挥重要作用。GSDMD、GSDMA3和 GSDMA的gasdermin
‑
N结构域具有结合膜脂、磷酸肌醇和心磷脂以及破坏磷脂膜等功能。gasdermin
‑
N还含有裂解的磷酸肌醇/心磷脂的脂质体，并能在人造或天然的磷脂膜上打孔，所造成的孔内径为10
‑
14 nm。GSDME的gasdermin
‑
N结构域介导的程序性细胞死亡具有明显的形态学特征，并影响质膜通透性和水的流入，导致细胞肿胀，出现典型的气泡和渗透性裂解。高等动物的GSDM主要在治疗恶性肿瘤、神经系统疾病及激活抗菌免疫反应中具有潜在的应用价值。在无脊椎动物中，目前仅在珊瑚中发现了GSDME，但未发现其具有抗菌免疫功能。迄今为止未见关于重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N、制备方法及其应用的相关报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N、制备方法及其应用本专利技术的技术解决方案是：一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N，氨基酸序列特征如SEQ ID NO. 1所示。
[0004]一种上述重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N的制备方法，依次按照如下步骤进行：a. 用引物P1和P2对长牡蛎CgGSDME
‑
N编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO. 2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；b. 将PCR扩增产物与pET30a载体分别经EcoRI和Xhol I酶切后通过T4连接酶连接，转化，构建重组子；c. 将所述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，得到重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N。
[0005]一种上述重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N在制备抗灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌药物中的应用。
[0006]本专利技术采用特定引物对长牡蛎CgGSDME
‑
N编码区片段进行PCR扩增，分别将PCR扩增产物与pET30a载体经EcoRI和Xhol I酶切后通过T4连接酶连接，转化，构建重组子；并将重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）中进行诱导培养，而后纯化、复性后获得。所制备的重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N可以结合多种细菌（金黄色葡萄球菌、灿烂弧菌、大肠杆
菌、嗜水气单胞菌和鳗弧菌），并可以直接杀死灿烂弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌且可抑制灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌的生长，可应用于制备抗灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌的药物。
附图说明
[0007]图1是本专利技术实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N与细菌结合活性检测效果图。
[0008]图2是本专利技术实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N杀菌活性检测效果图。
[0009]图3是本专利技术实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N抑制细菌生长检测效果图。
具体实施方式
[0010]本专利技术的重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N的制备方法，依次按照如下步骤进行：1. 重组载体的构建本专利技术实施例采用重组载体为Novagen公司pET
‑
30a(+)原核表达载体。通过PCR技术，采用5
’
末端分别添加了EcoRI和Xhol I限制性酶切位点引物P1和P2，对长牡蛎CgGSDME
‑
N mRNA编码区进行扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO. 2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011]PCR反应条件为：首先94℃预变性5 min，然后进入下列循环：94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min；利用琼脂糖胶电泳将扩增片段纯化回收，与pMD19
‑
T载体连接；转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用EcoRI和Xhol I对质粒进行双酶切；回收目的片段与经EcoRI和Xhol I酶切的表达载体pET
‑
30a(+)连接，完成重组质粒的构建。
[0012]2. 重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N的表达将构建好的重组质粒转化表达大肠杆菌Transetta（DE3）中，挑取单克隆，接种于200 mL LB液体培养基中，220 rpm，37℃培养至OD
600
=0.4~0.8；加入IPTG（终浓度1 mmol/L），继续培养4 h后于4℃，10,000 rpm离心5 min，收集菌体，于
‑
80℃冻存备用；同时取1 mL菌液离心，弃去上清后，加入80 μL水和20 μL 5
×
蛋白上样缓冲液，99℃煮沸10 min，稍离心，SDS
‑
PAGE检测表达产物。
[0013]3. 重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N的纯化与复性将表达产物采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：（1）镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6
×
20 cm，柱床体积为10 mL；（2）用缓冲液I（50 mmol/L Tris
‑
HCl缓冲液，pH 9.0，50 mmol/LNaCl，8 mol/L尿素）平衡2~5个床体积，流速为2 mL/min；（3）取经IPTG诱导表达细胞，用缓冲液I重悬，150 W超声破碎30 min，12,000 rpm，4℃离心30 min，上清液用0.45 μm滤膜过滤后，过柱，流速为1 mL/min；（4）用缓冲液I再洗2~5个床体积，流速为2 mL/min；
（5）用含50 mmol/L咪唑缓冲液I再洗2~5个柱床体积，流速为2 mL/min；（6）用含400 mmol/L咪唑缓冲液I洗脱目的蛋白，收集；（7）用SDS
‑
PAGE检测融合蛋白表达；（8）用纯水流洗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N，其特征在于：氨基酸序列特征如SEQ ID NO. 1所示。2.一种如权利要求1所述重组长牡蛎焦孔素蛋白rCgGSDME
‑
N的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a. 用引物P1和P2对长牡蛎CgGSDME
‑
N编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO. 2所示，所述引物P2的DNA序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋林生，孙洁洁，冷金源，王玲玲，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：