本发明专利技术涉及一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法及其应用，RfA1蛋白的氨基酸序列由保守的基序以及基序之间非保守的连接片段组成，是一种天然嵌段共聚物，通过对其嵌段排列的氨基酸序列进行重新设计，对基序和连接片段进行重新组合，本发明专利技术提供了一种蛋白标签的模块化设计方法，并获得了两种分别将外源蛋白严格定位于胞质、核质当中的蛋白标签，该方法及两种多肽标签，可以将不同的功能蛋白定位于胞质、或协助其转运到核质当中，可有效提高功能蛋白的靶标能力，有望应用于生物技术、生物医药等领域。生物医药等领域。生物医药等领域。
【技术实现步骤摘要】
A1，以下简称RfA1)的全长蛋白，设计的基本模块为RfA1中氨基酸序列保守的基序(reflectin moitfs，以下简称RM)以及非保守的连接片段(reflectin linkers，以下简称RL)。
[0008]所述的“RM”或“RL”为RfA1模板基因所提供的模块化单元，可根据应用需求进行更替、增减，以调节目的蛋白的胞质、核质定位，或者胞质、核质分布比例。
[0009]所述的“胞质、核质定位”方法，是指将需要研究的目的蛋白连接到仿生多肽的C端或N端。例如，如需实现专一性的胞质定位，则将目的蛋白与以RM
N
+RM1*5为代表的胞质定位多肽相连；如需特异性地定位于细胞核中，则将目的蛋白与以RM1*3+RL2*2为代表的核质定位多肽相连接。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，包括以下步骤：
[0012](a)提供一种胞质、核质定位多肽的设计模板及设计思路：胞质、核质定位多肽的设计模板源自于RfA1蛋白序列；
[0013](b)RfA1各个基序、连接片段的分子量、等电点、解离常数等数据通过ExPASy
‑
ProtParam tool进行计算；
[0014](c)设计两条多肽作为标签，分别命名为RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2，前者保留RfA1所有的天然连接片段，将除了RM
N
以外的所有基序替换为RM1，后者采用3段RM1模块与2段RL2模块，构建了一种不同于模板RfA1的整齐、规律的嵌段结构；RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2序列采用化学合成的方法合成；
[0015](d)将外源蛋白连接在RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端得到重组质粒；
[0016](e)通过脂质体转染，将上步骤得到的重组质粒转移到细胞当中，外源蛋白表达的同时，外源蛋白的C端连接上多肽标签RM
N
+RM1*5或RM1*3+RL2*2，然后通过细胞转染，细胞核染色，细胞膜染色，通过共聚焦显微镜观察外源蛋白带上标签蛋白后的细胞内定位情况；
[0017]步骤(c)所述的RM
n
+RM1*5的序列结构及氨基酸构成：
[0018]MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGMEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDRYYDYYGRMHDHDRYYGRSMFNQGHSMDSQRYGGWMDNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFNHHMYGRNMCYPYGNHYYNRHMEHPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRHCNPFGQMWHNRHGYYPGHPHGRNMFQPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFSHNYGRHMNYPGGHYNYHHGRYMNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYIDNFDRNYYDYHMY
[0019]步骤(c)所述的RM1*3+RL2*2的序列结构及氨基酸构成：
[0020]PERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDSPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGR。
[0021]本专利技术中：
[0022]步骤(c)所述的RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2序列采用化学合成的方法合成。
[0023]步骤(d)所述的将外源蛋白连接在RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端，优选将GFP蛋白连接在RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端，即将GFP蛋白无缝拼接构建于pEGFP
‑
C1载体GFP序列C段。
[0024]步骤(e)中，优选通过细胞转染12小时后，细胞核以DAPI染色，细胞膜以DiD染色。
[0025]本专利技术还涉及一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法的应用，经系统研究，本专利技术人发现RfA1全长蛋白在细胞内表达后呈现显著的胞质富集、胞质定位特性，且其截断物的胞质/核质分布比例是依据其RM、RL重复次数严格量化可调的。基于此，以模块化单元RM、RL为组件，用于胞质定位多肽、核质定位多肽的设计与使用，也用于功能蛋白研究过程中的细胞内定位，还用于提高蛋白、多肽类药物的靶标性能，具有潜在应用前景。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0027]1、在目前涉及RfA1基因的研究中，编码多肽的基因是通过分子克隆的手段从RfA1基因中获得，而本专利技术所述的一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，为了突出模块化的设计思路，本专利技术设计了两条多肽，分别命名为RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2，前者保留RfA1所有的天然连接片段，将除了RM
N
以外的所有基序替换为RM1，后者则采用3段RM1模块与2段RL2模块，构建了一种不同于模板RfA1的整齐、规律的嵌段结构，与此同时，由于RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2对应的核酸序列无法通过分子克隆从RfA1基因中获取，因此采用化学合成的方法合成。
[0028]2、本专利技术所述的一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，提供了一种天然的生物模板RfA1，其序列由氨基酸组成较为保守的基序、以及基序间非保守的连接片段组成，是一种天然的嵌段共聚物。由于其蛋白质序列天然地被拆分为几个部分，因此可对其进行模块化地设计与重组。本专利技术中，通过对基序以及连接片段的数量进行控制，实现其在哺乳动物细胞内高效的、专一性的分布，即只存在于胞质中而不在核质中、或只存在于核质中而不存在与胞质中。本专利技术所设计的蛋白标签设计方案、蛋白标签模板以及两种标签蛋白演示例，可实现功能蛋白分子在细胞内的特异性的胞质/核质定位，对于研究蛋白的生物功能以及提高多肽/蛋白类药物的靶标效率具有潜在应用价值。
附图说明
[0029]图1RfA1全长蛋白与GFP串联后，在细胞内表达后的分布情况的图(a：细胞核DAPI染色(蓝色)；b：RfA1蛋白串联GFP(绿色)；c：细胞膜DiD染色(红色)；d：融合信号)；
[0030]图2RfA1蛋白序列中基序、连接片段分布示意图；
[0031]图3多肽标签RM
N
+RM1*5及RM1*3+RL2*2的序列示意图及其氨基酸构成信息的图；
[003本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种实现外源蛋白在哺乳动物细胞内可控胞质、核质定位的方法，其特征在于：包括以下步骤：(a)提供一种胞质、核质定位多肽的设计模板及设计思路：胞质、核质定位多肽的设计模板源自于RfA1蛋白序列；(b)RfA1各个基序、连接片段的分子量、等电点、解离常数等数据通过ExPASy
‑
ProtParam tool进行计算；(c)设计两条多肽作为标签，分别命名为RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2，前者保留RfA1所有的天然连接片段，将除了RM
N
以外的所有基序替换为RM1，后者采用3段RM1模块与2段RL2模块，构建了一种不同于模板RfA1的整齐、规律的嵌段结构；RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2序列采用化学合成的方法合成；(d)将外源蛋白连接在RM
N
+RM1*5与RM1*3+RL2*2的N端得到重组质粒；(e)通过脂质体转染，将上步骤得到的重组质粒转移到细胞当中，外源蛋白表达的同时，外源蛋白的C端连接上多肽标签RM
N
+RM1*5或RM1*3+RL2*2，然后通过细胞转染，细胞核染色，细胞膜染色，通过共聚焦显微镜观察外源蛋白带上标签蛋白后的细胞内定位情况；步骤(c)所述的RM
n
+RM1*5的序列结构及氨基酸构成：MNRYLNRQRLYNMYRNKYRGMEPMSRMTMDFQGRYMDSQGRMVDRYYDYYGRMHDHDRYYGRSMFNQGHSMDSQRYGGWMDNPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRFNNPFGQMWHGRQGHYPGYMSSHSMYGRNMYNPYHSHYASRHFDPERYMDMSGYQMDMQGRWMDAQGRYVNPFNHHMYGRNMCYPYGNH...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋俊祎，胡碧茹，叶宗煌，曾玲，李保山，刘梁程，唐佳文，
申请(专利权)人：中国人民解放军国防科技大学，
类型：发明
国别省市：
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