一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签及其应用制造技术

一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签及其应用，属于生物技术领域。为解决大规模生产中纳米抗体表达量低的问题，本发明专利技术提供了一种通过添加丝素蛋白序列标签来促进蛋白表达的方法，所述丝素蛋白序列标签为天然丝素蛋白中的高频肽段GAGAGS，或为对高频肽段GAGAGS重复1～50次获得的肽段。将本发明专利技术所述的丝素蛋白标签与纳米抗体在大肠杆菌中进行融合表达，提取蛋白溶液后，进行镍柱纯化，可获得具有高表达量特点的纳米抗体，并且不影响纳米抗体的活性。本发明专利技术提供的促表达方法步骤简单，促表达效果明显，成本低，适用范围广，符合常规工业大批量生产要求。业大批量生产要求。业大批量生产要求。

【技术实现步骤摘要】
一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，抗体届的“新贵”纳米抗体发展迅速，受到了广泛关注。纳米抗体是羊驼或骆驼血液中的具有特殊结构的重链抗体的可变区，称做VHH抗体，因其晶体直径只有2.5nm，长4nm，所以被称为纳米抗体，纳米抗体是自然界可与抗原结合的最小片段。纳米抗体性质非常稳定，具有耐高温、耐强酸强碱的特点，另外纳米抗体的分子量相较于传统抗体非常小，具有优异的组织渗透性以及血脑屏障穿透能力，因此，近年来纳米抗体技术被评为最值得关注的十大新一代生物技术平台之首，其在诊断、医学成像、检测、蛋白质结晶、肿瘤靶向诊断及治疗等领域受到越来越多的关注。
[0003]纳米抗体的结构简单，可以利用大肠杆菌微生物体系进行大规模生产，然而在使用摇瓶表达纳米抗体时，通常伴随着表达量低的问题。可以通过添加融合标签来促进目的蛋白表达，如GST标签，但因其分子量大(26kDa)，纯化后需与纳米抗体酶切分离，这使下游处理步骤繁琐复杂，并不适用于纳米抗体的表达。另外常用的亲和标签如His6标签，虽有助于纳米抗体的纯化，然而并不能促进纳米抗体的表达量。
[0004]丝素蛋白是蚕丝的主要成分，丝素蛋白中包含18种氨基酸，其中最主要的是丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly)。丝素蛋白序列的特点是含有许多主要氨基酸(Ala，Ser，Gly)组成的肽段重复序列，这些肽段重复序列具有疏水的特征。丝素蛋白作为生物医用高分子材料，已广泛应用于组织工程、伤口敷料、药物缓释材料等方面。

技术实现思路

[0005]为解决大规模生产中纳米抗体表达量低的问题，本专利技术提供了一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签，所述丝素蛋白序列标签为天然丝素蛋白中的高频肽段，或为对所述高频肽段重复1～50次，所述高频肽段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0006]进一步地限定，所述丝素蛋白序列标签的位置可以添加在目的蛋白的N端或者C端。
[0007]本专利技术还提供了上述丝素蛋白序列标签在提高蛋白表达量中的应用。
[0008]进一步地限定，所述应用为提高纳米抗体的表达量。
[0009]本专利技术还提供了利用上述丝素蛋白序列标签提高纳米抗体表达量的方法，包括如下步骤：
[0010]1)将纳米抗体序列与所述丝素蛋白标签序列通过全基因合成，经酶切、连接，以构建融合丝素蛋白标签的纳米抗体表达载体；
[0011]2)将步骤1)获得的融合丝素蛋白标签的纳米抗体表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中以获得纳米抗体表达菌株；
[0012]3)对步骤2)获得的纳米抗体表达菌株进行诱导，离心收集菌体；
[0013]4)对步骤3)获得的菌体进行蛋白提取，以获得粗蛋白样品；
[0014]5)将步骤4)获得的粗蛋白样品进行纯化，获得纳米抗体。
[0015]进一步地限定，步骤1)所述合成中，可将丝素蛋白序列标签放在纳米抗体序列的N端或者C端；所述表达载体为大肠杆菌表达载体pMES4、pET系列载体和pCold中的任意一种。
[0016]进一步地限定，步骤2)所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，BL21(DE3)PlysS，Rosetta和TG1中的任意一种。
[0017]进一步地限定，步骤3)是将步骤2)获得的表达菌株在LB培养基中37℃培养至OD
600
为0.4～1.0时，向菌液中加入浓度为0.1mM～1mM的IPTG诱导剂，16
‑
37℃培养2h
‑
20h，而后将菌液离心收集菌体。
[0018]进一步地限定，所述步骤4)是向步骤3)获得的菌体中加入蛋白提取液，冰上涡旋30～40min，获得周质蛋白溶液，离心后收集上清获得粗蛋白样品。
[0019]进一步地限定，步骤5)所述纯化是利用预装镍柱进行纯化，而后经超滤管浓缩、换液至缓冲液中，以获得纯蛋白。
[0020]本专利技术的有益效果：
[0021]本专利技术提供了一种通过添加丝素蛋白序列标签来促进蛋白表达的方法，并且将本专利技术所述的丝素蛋白标签与纳米抗体在大肠杆菌中进行融合表达，提取蛋白溶液后，进行镍柱纯化，可获得具有高表达量特点的纳米抗体，并且丝素蛋白标签与纳米抗体融合表达后不影响纳米抗体的活性。此外，本专利技术提供的促表达方法步骤简单，促表达效果明显，成本低，适用范围广，符合常规工业大批量生产要求。
附图说明
[0022]图1为Anti
‑
HE4纳米抗体1A8融合丝素蛋白1C
‑
5C标签的表达结果图；
[0023]图2为Anti
‑
HE4纳米抗体1A8融合丝素蛋白1C
‑
5C标签的纯化结果图；
[0024]图3为Anti
‑
HE4纳米抗体3C8、1G8、1A8融合丝素蛋白1C
‑
5C标签表达量的对比结果图；
[0025]图4为Anti
‑
CEA纳米抗体11C12融合丝素蛋白10
‑
50C标签的纯化结果图；
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的保护范围构成任何限制。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明，所有化学试剂均为商用常规分析纯试剂。
[0027]以下实施例中选用的anti
‑
HE4的纳米抗体1A8公开于申请号为CN202110415506.9的专利中；
[0028]anti
‑
HE4的纳米抗体1G8公开于申请号为CN202110415499.2的专利中；
[0029]anti
‑
HE4的纳米抗体3C8公开于申请号为CN202110415494.X的专利中；
[0030]anti
‑
CEA的纳米抗体11C12公开于申请号为CN201710120052.6的专利中。
[0031]实施例1：一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签
[0032]一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签，选取天然丝素蛋白氨基酸序列中高频出现的肽段GAGAGS序列并命名此序列为1C标签，将1C序列标签进行多次重复分别得到2C、3C、4C、5C序列标签，其氨基酸序列如下：
[0033]丝素蛋白1C标签的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
[0034]5’‑
GAGAGS
‑3’
[0035]丝素蛋白2C标签的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：
[0036]5’‑
GAGAGSGAGAGS
‑3’
[0037]丝素蛋白3C标签的氨基酸序列如S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可提高蛋白表达量的丝素蛋白序列标签，其特征在于，所述丝素蛋白序列标签为天然丝素蛋白中的高频肽段，或为对所述高频肽段重复1～50次，所述高频肽段的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的丝素蛋白序列标签，其特征在于，所述丝素蛋白序列标签的位置可以添加在目的蛋白的N端或者C端。3.权利要求1所述丝素蛋白序列标签在提高蛋白表达量中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为提高纳米抗体的表达量。5.一种利用权利要求1所述丝素蛋白序列标签提高纳米抗体表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将纳米抗体序列与所述丝素蛋白标签序列通过全基因合成，经酶切、连接，以构建融合丝素蛋白标签的纳米抗体表达载体；2)将步骤1)获得的融合丝素蛋白标签的纳米抗体表达载体转化至大肠杆菌感受态细胞中以获得纳米抗体表达菌株；3)对步骤2)获得的纳米抗体表达菌株进行诱导，离心收集菌体；4)对步骤3)获得的菌体进行蛋白提取，以获得粗蛋白样品；5)将步骤4)获得的粗蛋白样品进行纯化，获得纳米抗体。6.根据权利要求5所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭杨，刘文帅，年锐，于建立，樊喜英，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：