一种降低或消除重组蛋白CEX酸性峰的方法技术

本发明专利技术针对含有GS类连接子的重组蛋白纯化后存在影响生物活性酸性峰的技术问题，根据酸性峰的产生受GS类连接子中丝氨酸残基上以木糖为核心的O

【技术实现步骤摘要】
一种降低或消除重组蛋白CEX酸性峰的方法


[0001]本专利技术涉及药物纯化工艺研究领域，特别是涉及一种降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法。具体而言，本专利技术涉及一种降低或消除重组人源化抗NKG2A和PD
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L1双特异性抗体（6MW3411双抗）中含O
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木糖修饰的酸性变异体的纯化方法。

技术介绍

[0002]近几年来，肿瘤免疫治疗取得了前所未有的成功，仍只有少数患者表现出持久的疗效。改善临床响应以及克服耐药机制是肿瘤免疫治疗领域正面临的挑战，而阻断其它抑制性免疫受体可能是一种可行的策略。
[0003]NKG2A（killer cell lectin like receptor C1）又名KLRC1或CD159A，是一类II型跨膜蛋白，属于NKG2/CD94自然杀伤细胞凝集素受体家族。NKG2A在胞外具有识别碳水化合物的结构域CRD(Carbohydrate
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recognitiondomain，通常由115
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130个氨基酸组成，含2
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3个二硫键，有2
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3个N连接的糖基化位点，其配体识别的过程往往是Ca2+依赖性的)。NKG2A主要在NK细胞、NKT细胞以及T细胞中表达；相对分子质量为43000，由233个氨基酸组成，其胞外区有135个氨基酸。NKG2A通过与其配体HLA
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E的相互作用来抑制免疫细胞的激活。HLA
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E广泛表达于头颈癌、肺癌、前列腺癌以及结直肠癌等多种肿瘤细胞表面，而免疫细胞释放的IFN
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γ会进一步上调HLA
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E的表达 （J Clin Invest. 2019; 129(5): 2094
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2106）。与其它受体
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配体（如PD
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1/PD
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L1）类似，NKG2A/HLA
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E这对免疫检查点也是肿瘤免疫逃逸的重要信号通路，阻断NKG2A/HLA
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E之间的相互作用成为了肿瘤免疫治疗领域一个非常有潜力的靶点。目前有多家公司（如Innate Pharma/Novo Nordisk/AstraZeneca 和 ChemPartner）开发了针对NKG2A的单克隆抗体，通过阻断NKG2A/HLA
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E的相互作用来提高NK细胞以及T细胞的免疫活性来杀伤肿瘤细胞。
[0004]最新的研究发现，NKG2A与PD
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1在头颈癌及黑色素瘤浸润性的CD8+ T细胞上共表达，同时阻断NKG2A/HLA
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E及PD
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1/PD
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L1两条信号通路有很强的协同抗肿瘤作用（Cell. 2018; 175: 1
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13, Cell. 2018; 175: 1744
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1755）。同时针对多种靶点进行治疗对提高肿瘤免疫治疗的响应率及降低免疫耐受有积极的作用。目前针对NKG2A的治疗性抗体对抗原的亲和力不足、结合NKG2A单靶点对肿瘤的治疗效果不佳，全球范围内尚没有针对NKG2A的上市药物。法国Paoli
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Calmettes研究院正在推进一项人源化抗NKG2A单抗IPH2201与同种异体干细胞移植联用治疗血液恶性肿瘤的I期临床安全性实验（NCT02921685）。申请人已经通过构建轻重链突变抗体库进行亲和力提高和/或解离常数改善的突变抗体，将突变抗体的CDRs区构建人Fab重链基因表达载体和含人κ亚类轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中，将亲和力成熟抗体的重链载体和轻链载体交叉配对，筛选获得抗NKG2A的突变Fab抗体，连接人抗体Fc段。将抗PD
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L1纳米抗体通过linker连接到Fc段的C端，获得对NKG2A和PD
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L1具有双特异性的抗体。
[0005]与普通抗体相比，双特异抗体具有特异性好、靶向性强、起效剂量低、毒副作用小等优点，在肿瘤的临床治疗意义重大。人源化重组双特异性抗体为非天然结构的生物大分
子，在重组表达的翻译后修饰、折叠、组装、细胞内转运、分泌等过程中面临多种不确定因素。申请人针对前期研发的抗NKG2A/PD
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L1双特异性抗体的结构和纯化方法研究发现，采用本领域常用的抗体纯化方法（亲和层析、阴离子层析和阳离子层析）纯化抗NKG2A/PD
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L1双特异性抗体仍存在较高水平的酸性峰。这些酸性峰的存在不仅影响双特异性抗体制剂的理化性能，而且在临床研究中还会影响双特异性抗体药物的安全性及有效性。
[0006]对于双特异抗体酸性峰问题，申请人以抗NKG2A/PD
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L1双特异性抗体6MW3411为研究对象结合现有技术进行结构分析，推测其中采用的连接子是导致酸性峰产生的因素之一。6MW3411双抗含有(GGGGS)4连接子，用于连接抗NKG2A抗体重链的C端与抗PD
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L1纳米抗体（VHH）。(GGGGS)
n n≥2是人工设计的连接子，在融合蛋白、双特异性抗体等大分子药物中已被广泛应用。如已在FDA和EMA上市的Amgen的双抗药物Blincyto
®
（通用名Blinatumomab），使用了(GGGGS)3作为连接两个scFv的连接子。此类GS连接子普遍存在S上以木糖（xylose）为核心的O
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糖基化修饰情况，这种O
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糖基化修饰不仅导致双抗产生电荷异质性、表现为酸性变异体，而且还可能会对药物的免疫原性产生一定的影响、通过异源性激发不希望的免疫应答。

技术实现思路

[0007]针对含有GS类连接子的重组蛋白中存在酸性峰、影响生物活性的技术问题，本专利技术以抗NKG2A/PD
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L1双特异性抗体6MW3411为例，首先通过阳离子交换树脂证实了采用常规三步层析法纯化的双特异性抗体产品中存在酸性峰；然后对收集的酸性峰进行质谱分析发现所述酸性峰中6MW3411双抗的(GGGGS)4连接子上存在三种不同形式的O
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木糖修饰；进而通过对不同复合模式离子层析填料进行筛选，确定以纳微的NM90 Agarose HAM填料制备复合模式离子层析柱能够减少酸性峰的种类、降低酸性峰的比例。因此，本专利技术根据重组蛋白酸性峰的产生受GS类连接子中丝氨酸残基上以木糖为核心的O
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糖基化修饰影响的机理，提供了一种除去重组蛋白酸性峰的方法，采用多模式阴离子交换层析，除去O
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木糖修饰酸性变异体，通过阳离子交换色谱鉴定重组蛋白酸性峰降低至30%以下。本专利技术所述方法尤其适用于重组双特异性抗体（例如抗NKG2A/PD
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L1双特异性抗体）亲和层析后的进一步纯化。
[0008]具体而言：一方面，本专利技术提供一种降低或消除重组蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于将已经过常规方法纯化、CEX鉴定仍存在酸性峰的重组蛋白进一步采用以纳微的NM90 Agarose HAM填料的复合型离子交换层析进行分离，载量≤60 mg/mL，洗脱pH为pH 4.75
±
0.05，去除所述重组蛋白的酸性变异体；其中，所述重组蛋白分子中含有GS连接子，所述重组蛋白的酸性变异体是由GS连接子丝氨酸残基上以木糖为核心的O
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糖基化修饰产生，所述重组蛋白包含有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。2.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述GS连接子由式(GS)n表示，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。3.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述GS连接子由式(GGGGS)n表示，其中n为1、2、3、4或5。4.如权利要求1所述降低或消除重组蛋白阳离子交换色谱（CEX）酸性峰的方法，其特征在于所述重组蛋白包...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤玉环，董无善，欧阳子均，李纲，
申请(专利权)人：迈威上海生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：