用于寡核苷酸的脱保护的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于寡核苷酸的纯化的新方法，所述方法包括通过用酸进行柱上脱保护来去除寡核苷酸的5'

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于寡核苷酸的脱保护的方法
[0001]本专利技术涉及一种用于寡核苷酸的纯化的新方法，该方法包括通过用酸进行柱上脱保护来去除寡核苷酸的5'
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O
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寡核苷酸末端处的酸不稳定的5'羟基保护基团。
[0002]通常通过固相合成制备的寡核苷酸在其从固体支持物上切割后仍含有大量杂质。对于长度为15到20
‑
mer的标准单体，API纯度最好在70％到80％的范围内。对于经化学修饰的单体或更长的序列，API含量通常甚至更低。
[0003]已经开发了选择性分离方法来制备满足治疗应用规范的高纯度寡核苷酸。
[0004]在一种方法中，寡核苷酸在从固体支持物上切割后，在5'
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O
‑
寡核苷酸末端处留下酸不稳定的5'羟基保护基团。该基团的疏水性允许应用有效的色谱技术进行纯化。
[0005]粗制寡核苷酸通过以下步骤是常见的策略(例如Krotz等人，Organic Process Research&Development 2003,7,47
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52)：
[0006]a)反相色谱
[0007]b)浓缩和脱盐
[0008]c)在溶液中去除酸不稳定的5'羟基保护基团，和
[0009]d)进一步浓缩和脱盐
[0010]已发现，由于单个操作步骤a)至d)的数量，该已知方法需要大量操作时间。
[0011]本专利技术的目的是减少纯化步骤的数量并由此减少操作时间，并且还试图达到更高的总产率。
[0012]据发现，本专利技术的目的可以通过如上概述的用于寡核苷酸的纯化的新方法来达到。
[0013]阐述以下定义以说明和定义用于描述本专利技术的各种术语的含义和范围。
[0014]术语酸不稳定的5'羟基保护基团被定义为在合适的酸的帮助下可切割并具有疏水特性的保护基团。
[0015]典型的酸不稳定的5'羟基保护基团选自4,4'
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二甲氧基三苯甲基、4
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甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9
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苯基
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呫吨
‑9‑
、9
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(对甲苯基)
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呫吨
‑9‑
基或选自叔丁基二甲基甲硅烷基，优选地选自4,4'
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二甲氧基三苯甲基、4
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甲氧基三苯甲基或三苯甲基，或者甚至更优选地选自4,4'
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二甲氧基三苯甲基。
[0016]如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分子。为了用作具有治疗价值的寡核苷酸，通常合成含有长度为10个至40个核苷酸，优选地是10个至25个核苷酸的寡核苷酸。
[0017]寡核苷酸可由任选经修饰的DNA、RNA或LNA核苷单体或其组合组成。
[0018]LNA核苷单体是经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖环的C2'与C4'之间包含连接基基团或桥。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。
[0019]任选地，如本文所用的经修饰的是指与等同的DNA、RNA或LNA核苷相比，通过引入糖部分或核碱基部分的一个或多个(一种或多种)修饰而被修饰的核苷。在一个优选的实施例中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分，并且可以例如包含一个或多个2
’
取代的核苷和/或一个或多个LNA核苷。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的
“
单元”或经修饰的“单体”互换地使用。
[0020]DNA、RNA或LNA核苷通常通过磷酸二酯(P＝O)和/或硫代磷酸酯(P＝S)核苷间键连接，该键将两个核苷共价偶联在一起。
[0021]因此，在一些寡核苷酸中，所有核苷间键都可以由磷酸二酯(P＝O)组成，在其他寡核苷酸中，所有核苷间键都可以由硫代磷酸酯(P＝S)组成，或者在又其他寡核苷酸中，核苷间键的序列不同并且包含磷酸二酯(P＝O)和硫代磷酸酯(P＝S)核苷间键两者。
[0022]核碱基部分可以由每一个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例的寡核苷酸中，核碱基部分用大写字母A、T、G和
Me
C(5
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甲基胞嘧啶)描述DNA核苷。经修饰的核碱基包括但不限于带有保护基团的核碱基，所述保护基团例如叔丁基苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或二甲基甲脒基(参见维基百科，Phosphoramidit
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Synthese，https://de.wikipedia.org/wiki/Phosphoramidit
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Synthese 2016年3月24日)。
[0023]寡核苷酸合成的原理是本领域所熟知的(参见例如寡核苷酸合成；维基百科，免费的百科全书；https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide composition，2016年3月15日)。
[0024]现在更大规模的寡核苷酸合成是使用计算机控制的合成仪自动进行的。
[0025]通常，寡核苷酸合成是一种固相合成，其中正在组装的寡核苷酸通过其3'
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末端羟基共价结合到固体支持物材料上，并且在整个链组装的过程中保持与其附接。合适的支持物是市售的大孔聚苯乙烯支持物，如来自Cytiva的Primer支持物5G或来自Kinovate的HL支持物。
[0026]原则上，寡核苷酸合成是将核苷酸残基逐步添加到生长链的5'
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末端，直到组装出所需的序列。
[0027]通常，每次添加都称为合成循环，并且原则上由化学反应组成
[0028]a1)去封闭固体支持物上的5'保护羟基，
[0029]a2)将第一个核苷作为活化的亚磷酰胺与固体支持物上的游离5'羟基偶联，
[0030]a3)氧化或硫化相应的P
‑
连接的核苷以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；
[0031]a4)任选地，将固体支持物上的任何未反应的5'羟基封端，
[0032]a5)将附接在固体支持物上的第一个核苷的5'羟基去封闭；
[0033]a6)将第二个核苷作为活化的亚磷酰胺偶联以形成相应的P
‑
O连接的二聚体；
[0034]a7)氧化或硫化相应的P
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O连接的二核苷以形成相应的磷酸二酯(P＝O)或相应的硫代磷酸酯(P＝S)；
[0035]a8)任选地，将任何未反应的5'羟基封端；
[0036]a9)重复前面的步骤a5到a8直到组装出所需的序列。
[0037]可以用浓氨水进行随后从固体支持物上的切割。磷酸酯上和核苷酸碱基上的保护基团也在此切割程序中被去除。
[0038]粗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于寡核苷酸的纯化的方法，所述方法包括通过用酸进行柱上脱保护来去除所述寡核苷酸的5'
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O
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寡核苷酸末端处的酸不稳定的5'羟基保护基团。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述柱是离子交换色谱柱，优选地是阴离子交换色谱柱。3.根据权利要求1至2所述的方法，其中所述酸不稳定的5'羟基保护基团选自4,4'
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二甲氧基三苯甲基、4
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甲氧基三苯甲基、三苯甲基、9
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苯基
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呫吨
‑9‑
、9
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(对甲苯基)
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呫吨
‑9‑
基，或选自叔丁基二甲基甲硅烷基，优选地选自4,4'
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二甲氧基三苯甲基。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤a.用包含磷酸盐和有机溶剂的缓冲溶液对阴离子交换柱进行第一平衡；b.将粗制寡核苷酸的稀释的氨水溶液装载到所述柱上；c.用包含磷酸盐和有机溶剂的缓冲溶液对所述阴离子交换柱进行第二平衡；d.用包含磷酸盐、有机溶剂和碱卤化物的缓冲溶液洗涤所述柱；e.用包含磷酸盐和有机溶剂的缓冲溶液对所述阴离子交换柱进行第三平衡；f.所述用酸进行柱上脱保护；g.用包含磷酸盐和有机溶剂的缓冲溶液对所述阴离子交换柱进行第四平衡；h.用包含磷酸盐、有机溶剂和碱卤化物的缓冲溶液对脱保护的寡核苷酸进行洗脱，并且随后用包含磷酸盐、有机溶剂和碱卤化物的缓冲溶液对所述柱进行等度洗涤。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述缓冲溶液中的所述磷酸盐是选自碱磷酸盐或其混合物的磷酸盐，但优选地是磷酸一钠或磷酸二钠或其混合物。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述缓冲溶液中的所述磷酸盐的含量在10mM和40mM之间选择，...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔庸洛，姜溁求，金成原，郑京银，P，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：