醋酸曲普瑞林的纯化方法技术

本发明专利技术提供醋酸曲普瑞林的纯化方法，属于药物化学领域，包括将曲普瑞林粗肽溶液加载到以反相聚合物为固定相的色谱柱进行一次分离纯化，收集主峰样品1，加载到以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行二次分离纯化，收集主峰样品2，经过自制PGMA

【技术实现步骤摘要】
醋酸曲普瑞林的纯化方法


[0001]本专利技术属于药物化学领域，具体涉及醋酸曲普瑞林的纯化方法。

技术介绍

[0002]曲普瑞林，分子式C
64
H
82
N
18
O
13
，分子量1311.45，英文名：Triptorelin，商品名为色氨瑞林、达必佳、Decapeptyl等。曲普瑞林，以其醋酸盐或者巴莫酸盐的形式应用于临床，临床适应症包括前列腺癌、性早熟、辅助生殖技术，例如体外授精术、子宫内膜异位症和子宫肌瘤等。曲普瑞林是一种促性腺激素释放激素（GnRH）的类似物，主要作用于垂体前叶，大剂量应用初期可以引起一过性黄体生成素（LH）和卵泡雌激素（FSH）释放增多，后期则导致垂体敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌减少。
[0003]现有技术如授权公告号为CN 103012564 B的中国专利技术专利，公开了一种高纯度的曲普瑞林及其纯化方法。该高纯度的曲普瑞林经氨基酸光学纯检测，7个氨基酸的D
‑
型对映体比例相对于其相应氨基酸小于0.2%；D
‑
Arg相对于全部精氨酸小于0.2%；乙腈含量低于0.03%；甘氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及丝氨酸经氨基酸组成检测，各氨基酸的相对比值在0.9
‑
1.1之间。纯化方法包括步骤：（a）将待纯化的曲普瑞林用溶剂溶解，过滤得滤液；（b）将步骤（a）所得滤液加载到离子交换柱上，用流动相洗脱并使曲普瑞林转化成其盐，收集主峰流出液；（c）将步骤（b）所得流出液加载到硅胶柱上，用流动相洗脱，收集主峰洗脱液，除去溶剂，即得。该专利技术方法收率高，产品质量稳定，生产成本低，操作简单，适合大生产。为控制曲普瑞林原料杂质限量，提高纯度及收率，需要进一步研究分离纯化方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种醋酸曲普瑞林的纯化方法，该方法能够提高PGMA
‑
PEI
‑
GTA的动态载量，提高醋酸曲普瑞林的纯化收率和总收率，降低生产成本，缩短生产周期。
[0005]本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：提供一种醋酸曲普瑞林的纯化方法，包括以下步骤：a、将曲普瑞林粗肽用溶剂溶解，过滤得滤液；b、将步骤a所得滤液加载到以反相聚合物为固定相的色谱柱进行一次分离纯化，收集主峰样品1；其中，流动相A为0.15
‑
0.40 wt%磷酸二氢钠水溶液，pH2.0
‑
3.0；流动相B为乙腈，B相的洗脱梯度为20
‑
40 v/v%，洗脱时间50
‑
70 min；c、将主峰样品1加载到以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行二次分离纯化，收集主峰样品2；其中，流动相A为0.1
‑
0.15 v/v%三氟乙酸水溶液，pH2.0
‑
3.0；流动相B为乙腈；B相的洗脱梯度为20
‑
25 v/v%，洗脱时间50
‑
70 min；d、将主峰样品2经过PGMA
‑
PEI
‑
GTA阴离子交换介质进行洗脱转盐，收集主峰样品3，经冷冻干燥得到醋酸曲普瑞林纯品；其中，流动相为0.01
‑
0.05 v/v%醋酸水溶液；上述阴
离子交换介质的基质为PGMA
‑
EDMA，采用原子自由基悬浮聚合法制备，制备过程中所配制的水相中还包括三醋酸甘油酯和吡哆醇。相对于无机基质填料，有机基质填料的基质微球大多是选择各种天然的多糖为原料来制备，它们对于被分离样品具有很强的负载能力及较高的色谱容量，除此之外，还具有良好的耐酸、耐碱和耐溶剂处理的化学稳定性，在生物大分子的分离方面具有比较明显的优势。制备PGMA
‑
PEI
‑
GTA阴离子交换介质的PGMA
‑
EDMA基质时，在水相中加入一定的三醋酸甘油酯和吡哆醇，可以降低PGMA
‑
EDMA微球的平均孔径并增加孔隙率，使得PGMA
‑
EDMA微球具有较高的比表面积，使得PGMA
‑
PEI
‑
GTA阴离子交换介质在具有更高的离子交换容量的同时还具有较好的流通性，进而具有较高的动态载量，从而提高醋酸曲普瑞林的转盐率和纯化收率，降低生产成本，缩短生产周期。
[0006]在一些实施方式中，上述配制的水相中含有0.0005
‑
0.001 g/mL三醋酸甘油酯。更进一步地，三醋酸甘油酯与吡哆醇的质量比为7.4
‑
10∶1。
[0007]在一些实施方式中，上述步骤a所用溶剂为5
‑
10 v/v%乙腈水溶液。进一步地，上述步骤a中溶剂按照0.08
‑
0.12 g/mL的浓度溶解曲普瑞林粗肽。
[0008]在一些实施方式中，上述十八烷基硅烷键合硅胶的平均孔径为7
‑
9 μm，特征孔径为110
‑
150
ꢀÅ
。
[0009]在一些实施方式中，上述曲普瑞林粗肽采用固相逐步合成法或固相片段缩合法或液相合成法制得。进一步地，上述曲普瑞林粗肽采用固相逐步合成法制得。
[0010]在一些实施方式中，上述基质PGMA
‑
EDMA的制备步骤包括：将PVA（聚乙烯醇）、三醋酸甘油酯、吡哆醇、SDS（十二烷基硫酸钠）溶解于去离子水中配成水相；将单体GMA（甲基丙烯酸缩水甘油酯）、交联剂EDMA（乙二醇二甲基丙烯酸酯）、致孔剂、CuBr（溴化亚铜）和BPY（联二吡啶）混合，最后加入EPB（溴代丙烯酸乙酯），对溶液充分搅拌，组成油相；在机械搅拌的条件下，边向水相中通N2排除O2边将配制的油相缓缓加入，升高温度至38
‑
60℃，反应6
‑
10 h，用去离子水和乙醇分别洗涤2
‑
4次，自然风干，制得PGMA
‑
EDMA微球。进一步地，水相中含有0.03g/mL PVA。进一步地，GMA与致孔剂的体积比为1∶1
‑
3。进一步地，上述致孔剂包括二氯甲烷和正辛醇，且二氯甲烷和正辛醇的体积比为1∶1
‑
3。进一步地，GMA与EDMA的体积比为1
‑
1.8∶1。
[0011]在一些实施方式中，上述PGMA
‑
PEI
‑
GTA阴离子交换介质的制备方法包括：取PGMA
‑
EDMA微球4.2
‑
5.0 g，加入40
‑
60 mL二氧六环溶液，加入8
‑
12 g PEI液体，在58
‑
62℃水浴条件下振荡反应18
‑
26 h，转速120
‑
140 rpm，反应结束后冷却至18
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醋酸曲普瑞林的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：a、将曲普瑞林粗肽用溶剂溶解，过滤得滤液；b、将步骤a所得滤液加载到以反相聚合物为固定相的色谱柱进行一次分离纯化，收集主峰样品1；其中，流动相A为0.15
‑
0.40 wt%磷酸二氢钠水溶液，pH2.0
‑
3.0；流动相B为乙腈，B相的洗脱梯度为20
‑
40 v/v%，洗脱时间50
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70 min；c、将主峰样品1加载到以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行二次分离纯化，收集主峰样品2；其中，流动相A为0.1
‑
0.15 v/v%三氟乙酸水溶液，pH2.0
‑
3.0；流动相B为乙腈；B相的洗脱梯度为20
‑
25 v/v%，洗脱时间50
‑
70 min；d、将主峰样品2经过PGMA
‑
PEI
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GTA阴离子交换介质进行洗脱转盐，收集主峰样品3，经冷冻干燥得到醋酸曲普瑞林纯品；其中，流动相为0.01
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【专利技术属性】
技术研发人员：张启鹏，吴潇钿，马奔，叶有志，
申请(专利权)人：浙江湃肽生物有限公司南京分公司，
类型：发明
国别省市：