一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用制造技术

本发明专利技术属于ASFV核酸检测领域，公开了一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用。本发明专利技术所提供的LAMP引物可以很好的区分非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株，且具有灵敏度高、特异性好的特点，同时该方法中的保守基因B646L基因的引物可以检测中国现阶段流行的所有基因型的毒株，B646L基因、EP402R基因和MGF_360

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用


[0001]本专利技术属于ASFV核酸检测领域，具体涉及到一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合及应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever，简称ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的临床表现为高热、出血、呼吸困难、内脏器官广泛性出血的高度接触性传染性疾病，主要在家猪和野猪之间传播，也可通过软蜱传播，其特点是病程快、传播广、死亡率高。
[0003]2020年5月，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所报道了一株人工缺失基因的非洲猪瘟弱毒活疫苗对家猪具有良好的安全性和有效性。该研究团队还证明，该疫苗完全具备大规模生产条件。该疫苗是目前最具实现产业化应用前景的疫苗，将为我国及有关国家非洲猪瘟疫情的有效防控提供重要技术手段。由于市面上对ASFV的检测大多是对保守基因B646L进行检测，加之该疫苗为弱毒活疫苗，因此该疫苗的使用会导致常规方法检测结果为阳性，无法确定是接种了疫苗导致的阳性还是感染了野毒导致的阳性，因此需要对它们进行区分。
[0004]B646L基因(p72)是包括野生型和基因缺失型株在内的所有ASFV的保守区域，选择该基因作为靶基因以区分ASFV与其他病毒。申请CN110551695A提供了一种非洲猪瘟病毒基因缺失弱毒株，该弱毒株是缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物EP402R基因和三个多基因家族区段(MGF
‑
360
‑
12L、MGF
‑
360
‑
13L、MGF
‑
360
‑
14L)编码产物；中国专利CN110093324B公开了一种基因II型的非洲猪瘟病毒MGF
‑
360
‑
505R缺失和CD2v与MGF
‑
360
‑
505R联合缺失的基因缺失病毒。因此以B646L基因(p72)、MGF多基因家族区段(MGF
‑
360
‑
12L、MGF
‑
360
‑
13L、MGF
‑
360
‑
14L)和EP402R(CD2v)作为靶标，可以确定猪是感染了野生型ASFV还是基因缺失株。
[0005]关于非洲猪瘟病毒的检测，国内外研究人员建立了多种核酸检测方法，主要分为病原学检测和血清学检测。目前，已经报道的区分野生型和基因缺失型的检测方法大多是荧光定量PCR，该方法灵敏度虽好但是探针的合成价格昂贵，而且需要使用专业的荧光定量PCR仪器进行检测，各仪器之间性能差异大，实验结果的分析需要专业的培训。因此，本研究通过建立非洲猪瘟的环介导等温检测方法，研制出一种高效快速区分非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的方法，解决基层猪场非洲猪瘟检测成本高、操作复杂的问题。利用本专利技术提供的引物，比CN110885905A中公布的引物具有更强的灵敏性。
[0006]环介导的等温扩增技术(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本研究人员Notomo等专利技术的一种新型的体外等温扩增特异性核酸片段的技术。该技术主要是利用两对特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合并进行链
置换扩增反应。该技术克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，并避免了反复升降温的耗时过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。LAMP技术是一种崭新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。常规PCR仅需要一对引物即可完成扩增，而LAMP方法利用两对特殊引物即外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，保证了方法的特异性，同时还可再引入一对环引物LF、LB，可以进一步提高扩增效率。影响LAMP扩增效果的因素非常复杂，可以说实验中的各个参数，都会对最后的结果造成影响。比如，为了保证引物末端的稳定性，F2/B2、F3/B3和LF/LB的3'端和F1c/B1c的5'端的设计最好使自由能小于等于
‑
4kcal/mol；引物设计原则还与GC含量有关，一般设置为GC含量在40％～60％，GC含量50％～60％时可以设计出更好的引物，但是引物组的数量会大大减少，因此调整到合适的GC含量非常重要。
[0007]申请号为2018109877089就提到：LAMP引物设计对靶基因的GC含量要求很高，并非所有的序列都适合设计LAMP引物，同时，在实际操作过程中也发现，并非设计出的6条LAMP引物就适合进行扩增。有时候环引物的加入反而会使扩增的特异性变差。因此，最终的LAMP扩增效果取决于目的片段的选取以及LAMP引物的有效设计。
[0008]因此，在确定了检测靶基因后，具体选择靶基因的哪一个片段，如何设计LAMP引物可以达到最大的灵敏度，是目前新的面临的问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供了一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合，所述的引物组合包括三组引物。
[0010]本专利技术的另一个目的在于提供了LAMP引物组合在制备非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株检测试剂盒中的应用。
[0011]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0012]一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合，包括下述引物对：
[0013]14
‑
B646L
‑
F3：CACACCAACAATAACCACC
[0014]14
‑
B646L
‑
B3：AGAGCTGTATCTCTATCCTGA
[0015]14
‑
B646L
‑
FIP：GAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCGCTCTTAAATGGCCCATTGA
[0016]14
‑
B646L
‑
BIP：ATCAACACCGAGATTGGCACAAGCTTATCTCTGCGTGG
[0017]14
‑
B646L
‑
LF：GGTAGGTTTTAATCCTA
[0018]14
‑
B646L
‑
LB：AACGCCATTATGCAGCC；
[0019]15
‑
CD2v
‑
F3：AGAAATAGAAAGTCCACCACC
[0020]15
‑
CD2v
‑
B3：GGAGGACACGGTTTAGGT
[0021]15<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测非洲猪瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物组合，包括下述引物对：14
‑
B646L
‑
F3：CACACCAACAATAACCACC14
‑
B646L
‑
B3：AGAGCTGTATCTCTATCCTGA14
‑
B646L
‑
FIP：GAGGATTTTGATCGGAGATGTTCCGCTCTTAAATGGCCCATTGA14
‑
B646L
‑
BIP：ATCAACACCGAGATTGGCACAAGCTTATCTCTGCGTGG14
‑
B646L
‑
LF：GGTAGGTTTTAATCCTA14
‑
B646L
‑
LB：AACGCCATTATGCAGCC；15
‑
CD2v
‑
F3 ：AGAAATAGAAAGTCCACCACC15
‑
CD2v
‑
B3：GGAGGACACGGTTTAGGT15
‑
CD2v
‑
FIP：GGTTCTCTGGGAGATGGTTCAGAAGAAGAACAATGTCAGCATG15
‑
CD2v
‑
BIP：CCTAAGCCTTACAGTCGTTATCAGAGGGAAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋卉，李凡，牛晓玉，董翎，陈燕虹，邱昌伟，陆梦琪，李萍，余鹏，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：