生产透明质酸的方法技术

本发明专利技术提出了一种生产透明质酸的方法。该方法包括将兽疫链球菌进行发酵处理，以便获得透明质酸，其中，所述发酵处理是在如下条件下进行的：在发酵处理开始后的0～6h内，所述发酵处理在pH为6.7～7.2的条件下进行的；在发酵处理开始后的6～12h内，所述发酵处理在pH为7.4～7.6的条件下进行的；在发酵处理开始后的12h以后，所述发酵处理在pH为6.5～9.0的条件下进行的。该方法相比于现有技术，透明质酸的产量显著提高。显著提高。

【技术实现步骤摘要】
生产透明质酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及生产透明质酸的方法。

技术介绍

[0002]透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。
[0003]发酵产量是发酵法生产透明质酸成本控制的关键。微生物发酵法生产透明质酸过程中， pH是细胞生长和产物合成的重要环境参数，是代谢活动的综合指标。目前专利文献报道的透明质酸发酵工艺的pH调控大多是恒控pH，如CN101649337A公布的一种透明质酸的制备方法，整个发酵过程为恒控pH7.0。然而，透明质酸菌体生长的最适pH往往并不是产物合成的最佳pH值，恒定pH不利于菌体生长或产物积累。目前也有专利报道pH变动调控的技术方案，如专利CN 1978658 A公开的一种间歇高pH协迫策略提高发酵生产透明质酸产量的方法，透明质酸产量可以由5.0g/L提升至6.7g/L，然而该技术方案工艺控制繁琐不利于生产化放大，且该技术方案长时间维持较高pH会影响菌体活力，较大程度会影响菌体生长，不利于透明质酸合成。
[0004]因此，找到提升产物合成但又不影响菌体活力的pH调控是透明质酸发酵工艺控制的关键。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0006]为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种生产透明质酸的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括将兽疫链球菌进行发酵处理，以便获得透明质酸，其中，所述发酵处理是在如下条件下进行的：在发酵处理开始后的0～6h内，所述发酵处理在pH为6.7～7.2 的条件下进行的；在发酵处理开始后的6～12h内，所述发酵处理在pH为7.4～7.6的条件下进行的；在发酵处理开始后的12h以后，所述发酵处理在pH为6.5～9.0的条件下进行的。
[0007]根据本专利技术实施例的生产透明质酸的方法在发酵前期，根据菌体生长特性和透明质酸分泌特性的情况合理进行pH调控，能够确保菌体最佳生长活力。发酵初期(0～6h)，根据兽疫链球菌菌体生长特性，选择适合于菌体生长的最佳pH，有利于菌体适应环境，快速生长；发酵中期(6～12h)，根据菌体生长和产物分泌特性，控制pH为7.4～7.6有助于发酵液实际pH不至于过低而影响菌体生长；在发酵中后期控制发酵在pH为6.5～9.0的条件下进行，可以在保证菌体细胞活性不受影响情况下，有利于减少副产物产生，促进菌体细胞分泌透明质酸。根据本专利技术实施例的方法，相比于现有技术，透明质酸的产量显著提高。
[0008]根据本专利技术的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0009]根据本专利技术的实施例，在发酵处理开始后的6～12h内，首先每隔1h将pH提高0.1～
0.2，待pH升至7.4～7.6后，控制所述发酵处理在pH为7.4～7.6的条件下进行。专利技术人发现，发酵中期(6～12h)，透明质酸出现缓慢积累，发酵液粘度逐渐增大，发酵罐的pH电极检测会出现检测值反馈滞后的现象，通过缓慢提高pH，每隔1h将pH提高0.1～0.2，一方面有助于发酵液实际pH不至于过低影响菌体生长，另一方面，避免快速提升pH影响菌体活力。
[0010]根据本专利技术的实施例，在发酵处理开始后的12～30h内，pH维持上下持续波动状态，所述波动的pH下限为6.5～7.0，pH上限为8.0～9.0。专利技术人发现，在发酵中后期12～30h内，采用pH波动性调控策略，能够兼顾菌体生长和产物合成，发挥发酵合成透明质酸的最佳状态。pH波动性控制为根据菌体活力进行的自动反馈调节，由于发酵过程不同时期的菌体活力有差异，pH波动的周期可进行相应的改变，如发酵中期的菌体活力最高时，pH波动周期最短，之后菌体活力减弱，相应的pH波动周期变长。根据菌体活力情况自动调节，在保证菌体细胞活性不受影响情况下，有利于减少副产物产生，促进菌体细胞分泌透明质酸。
[0011]根据本专利技术的实施例，在发酵处理开始后的0～6h内，首先使得发酵培养基pH自然下降至6.7～7.2后，控制所述发酵处理在pH为6.7～7.2的条件下进行。
[0012]根据本专利技术的实施例，通过加碱控制所述发酵处理在pH为6.7～7.2的条件下进行。专利技术人发现，菌体生长、合成代谢的过程持续分泌有机酸，如乙酸、乳酸和丙酮酸，会导致发酵液pH下降，因此，通过加碱控制发酵液的pH，使得pH稳定在6.7～7.2。
[0013]根据本专利技术的实施例，所加入的碱为氨水、20～30％浓度的NaOH或KOH溶液。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述发酵处理是在通气量为0.5～1vvm，转速为100～600rpm， 37℃的条件下进行29～31h。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述发酵处理的发酵培养基包括77g/L的葡萄糖，40g/L的蛋白胨，1.3g/L的KH2PO4，0.4g/L的MgSO4以及4g/L味精。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述兽疫链球菌的分类命名为Streptococcus equisubsp.zooepidemicus HEC-SE01，马链球菌兽疫亚种HEC-SE01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2020231，保藏日期为2020年06月22日，保藏地址为：中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学。进而根据本专利技术实施例方法的透明质酸的产量进一步提高。
[0017]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种生产透明质酸的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将兽疫链球菌菌种按照1％体积比接种至种子培养基中，36.5℃200～220rpm 的条件下培养17.5-18h，培养结束前，进行革兰氏染色镜检，无异常后接种至发酵培养基，在15L发酵罐，通气量0.5～1vvm，搅拌转速为100～600rpm，37℃的条件下发酵培养30h，其中，所述种子培养基包括10g/L的葡萄糖，15g/L的蛋白胨，5g/L的酵母浸粉，1.5g/L的 K2HPO4，0.35g/L MgSO4，pH 6.5；发酵过程中，发酵罐采用如下pH控制方式：发酵前期 0～6h内：接种后，发酵液pH自然下降至6.7～7.2后，20～30％浓度NaOH碱控维持发酵液pH至6.7～7.2；发酵中期6～12h内：6h开始每隔1h将pH提高0.1～0.2，待pH升至7.4～7.6，恒控pH至7.4～7.6；发酵中后期12～30h内：通过改变碱控自控程序参数、蠕动泵恒定速率及电磁阀打开时间使pH维持上下持续波动状态，pH波动下限为6.5～7.0，上限为8.0～9.0，直到发酵结束。根据本专利技术实施例的方法，相比于现有技术，透明质酸的产量显著提高。
[0018]本专利技术的附加方面和优点将在下面的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产透明质酸的方法，其特征在于，将兽疫链球菌进行发酵处理，以便获得透明质酸，其中，所述发酵处理是在如下条件下进行的：在发酵处理开始后的0～6h内，所述发酵处理在pH为6.7～7.2的条件下进行的；在发酵处理开始后的6～12h内，所述发酵处理在pH为7.4～7.6的条件下进行的；在发酵处理开始后的12h以后，所述发酵处理在pH为6.5～9.0的条件下进行的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵处理开始后的6～12h内，首先每隔1h将pH提高0.1～0.2，待pH升至7.4～7.6后，控制所述发酵处理在pH为7.4～7.6的条件下进行。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵处理开始后的12～30h内，pH维持上下持续波动状态，所述波动的pH下限为6.5～7.0，pH上限为8.0～9.0。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵处理开始后的0～6h内，首先使得发酵培养基pH自然下降至6.7～7.2后，控制所述发酵处理在pH为6.7～7.2的条件下进行。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过加碱控制所述发酵处理在pH为6.7～7.2的条件下进行。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所加入的碱为氨水、20～30％浓度的NaOH或KOH溶液。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵处理是在通气量为0.5～1vvm，转速为100～600rpm，37℃的条件下进行29～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：石江水，肖文龙，马雷磊，封海生，李峰，谢文平，
申请(专利权)人：宜昌东阳光生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：