比活和热稳定性提高的腈水合酶变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种比活和热稳定性提高的腈水合酶变体，所述的腈水合酶变体是由Klebsiella oxytoca来源的腈水合酶通过点突变获得的。本发明专利技术还涉及该酶在生物酶催化技术制备右旋酰胺酮洛芬的应用；使用本发明专利技术的腈水合酶变体催化生产右旋酰胺酮洛芬，底物转化率高，产物e.e.值>99％，酶投入量少，有效降低生物酶合成法生产右旋酮洛芬的成本，同时该酶的热稳定性大幅提高，有利于贮藏和使用。有利于贮藏和使用。

【技术实现步骤摘要】
比活和热稳定性提高的腈水合酶变体及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地，本专利技术涉及一种比活和热稳定性提高的腈水合酶变体及其在催化合成酰胺酮洛芬中的应用。

技术介绍

[0002]酮洛芬是2
‑
芳基丙酸类非甾体抗炎药(NSAIDs)，此类药物均具有一个手性中心，只有右旋体才具有抗炎抗风湿和镇痛作用，左旋体几乎没有药理活性且具有毒副作用{何凤慈等.酮洛芬及其手性对映体的研究进展[J].中国药房,2004,15(4):244
‑
246；梅之南等.右旋酮洛芬的药动学和药效学性质[J].中国新药杂志,1998,7(005):339
‑
341}。
[0003]目前，市售(S)
‑
(+)
‑
酮洛芬主要合成方法有传统的化学合成法、手性拆分以及生物酶合成法。化学合成法主要是不对称合成可通过6步反应，由烯丙醇通过sharpless环氧化制备得到(2S，3S)环氧化合物，再加入手性位移试剂，经过对映体选择性氢解后生成二醇，在RuO4/NaIO4的催化下，最终得到右旋酮洛芬，e.e.值达到98％这种方法的产率和对映体选择性较为理想，但是均需要用到传统的化学催化剂以促使反应快速进行，而大部分催化剂毒性较高、易燃且会造成环境污染，还有可能引入有害的副产物刘继东.酮基布洛芬的合成新方法及拆分新方法研究[D].2000；胡琦蔚等.生物催化法制备手性酮基布洛芬的研究进展[J].发酵科技通讯,2017,46(3):153
‑
157}。
[0004]另有手性拆分方法，专利CN101928214A采用国内廉价易得的(
‑
)
‑
葡辛胺作为拆分剂拆分(RS)
‑
酮洛芬，按一定比例混合后升温回流后降温结晶，对酮洛芬利用率达70％，不过该方法所需时间长，工艺繁杂。目前也有采用高分子印迹聚合物、色谱法对酮洛芬对映体进行拆分{姜吉刚等.分子印迹聚合物拆分消旋体酮洛芬[J].分析试验室,2004,23(003):56
‑
58，专利CN102516068B}。此类方法无成本优势，难以直面市场。也有研究利用微生物酶法进行酮洛芬拆分。马燕等人利用紫外诱变得到的微生物菌株在一定条件下进行发酵，利用菌体拆分(RS)
‑
酮洛芬，同时，还利用诺维信脂肪酶435催化酮洛芬酯拆分{马燕等.Novozym435催化酮洛芬酯化拆分研究[J].南京工业大学学报(自然科学版),2015,37(6):54
‑
60,68.}。专利CN103194467A在大肠杆菌中表达来自于古细菌的嗜热酯酶，利用菌体催化酮洛芬乙酯反应生成右旋酮洛芬。该方法最大的不足就是底物浓度低、反应时间长且产物e.e.值仅为90％。利用酯酶的缺点在于拆分率和产物e.e.值都不理想，底物浓度偏低问题也难以解决。
[0005]生物酶合成法可以一定程度上解决底物浓度和产物e.e.值偏低的问题。目前也有利用腈水合酶和酰胺酶双酶体系制备光学纯酮洛芬的报道。Norman Layh等以酮洛芬腈为唯一氮原筛选得到的菌株Rhodococcus sp.C3II能将酮洛芬腈转化为(S)
‑
(+)
‑
酰胺酮洛芬，e.e.值为99％，但转化率只有12％{Layh N,Knackmuss H J,Stolz A.Enantioselective hydrolysis of ketoprofen amide by Rhodococcus sp.C3II and Rhodococcus erythropolis MP 50[J].Biotechnology Letters,1995,17(2):187
‑
192.}。
[0006]R.Bauer等利用从根癌农杆菌中纯化得到的腈水合酶催化酮洛芬腈(氰基酮洛
芬)，(S)
‑
(+)
‑
酰胺酮洛芬的产率为30％，光学纯度大于90％；转化率为50％时，光学纯度下降至80％，转化率达到100％时生成的是外消旋酰胺酮洛芬{Bauer R,Knackmuss H J,Stolz A.Enantioselective hydration of2
‑
arylpropionitriles by a nitrile hydratase from Agrobacterium tumefaciens strain d3[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1998,49(1):89
‑
95.}。
[0007]上述所报道的方法转化率或光学纯度仍达不到生产要求，且光学纯度与转化率难以兼得。
[0008]腈水合酶是一种多亚基的金属酶类，由α亚基、β亚基组成多聚体结构。根据腈水合酶中心所含金属离子的不同，可将其分为铁型和钴型两类。另外，腈水合酶的正确表达还需要组装蛋白(accessory protein)的参与。来源于Klebsiella oxytoca的腈水合酶属于钴型腈水合酶，能够催化多种腈类的水解反应。Vojt
ě
ch Vejvoda等报道Klebsiella oxytoca的腈水合酶能够水解二苯腈、3
‑
甲苯腈、3
‑
氯苯腈、4
‑
氯苯腈、3
‑
羟基苯腈、4
‑
氨基苯腈、丙腈、丁腈、戊腈、2
‑
甲基
‑3‑
丁腈[Vojt
ě
ch Vejvoda,Ludmila Mart
í
nkov
á
,Alicja B.Vesel
á
,Kaplan,O.,Lutz
‑
Wahl,S.,&Fischer,L.,et al.(2011).Biotransformation of nitriles to hydroxamic acids via a nitrile hydratase
–
amidase cascade reaction.journal of molecular catalysis b enzymatic,71(1
‑
2),51
‑
55.]。EP1842907A1公开了Klebsiella oxytoca的腈水合酶能够水解2
‑
苯基丙腈、扁桃腈、苄腈、苯基乙腈、2
‑
苯基丁腈、2
‑
氨基苯乙腈、丁腈、甲基丙烯腈，并且具有良好的S手性选择性。Fa
‑
Mou Guo等报道Klebsiella oxytoca的腈水合酶能够水解丙腈、丁腈、异丁腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、2
‑
氰基吡啶、3
‑
氰基吡啶、4
‑
氰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
protein)的核苷酸，所述辅助蛋白选自任意来源的腈水合酶的辅助蛋白，优选地，所述辅助蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。8.包含权利要求7所述表达载体的宿主细胞。9.如权利要求8所述的宿主细胞，包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小龙，林洁，何玉兰，麦倩婷，杨志雄，谢文平，李文佳，
申请(专利权)人：宜昌东阳光生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：