一种H-蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于蛋白质工程领域。具体涉及利用蛋白质工程的定点突变技术改良H

【技术实现步骤摘要】
一种H
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蛋白及其应用
[0001]本申请是专利技术专利《一种H
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蛋白突变体及其应用》的分案申请，原案申请日为2020年12月1日，申请号为2020113836483，专利技术名称为《一种H
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蛋白突变体及其应用》。

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[0002]本专利技术属于蛋白质工程领域。具体来讲，涉及利用蛋白质工程的定点突变技术改良H
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蛋白，进而调控甘氨酸裂解酶系酶活。

技术介绍
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[0003]甘氨酸裂解系统(Glycine cleavage system,GCS)能够可逆的催化甘氨酸裂解与合成反应，裂解反应将甘氨酸分解为二氧化碳和氨，与此同时，生成还原型辅酶(NADH)和一碳单元5,10
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亚甲基四氢叶酸；合成反应以二氧化碳、氨、NADH和5,10
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亚甲基四氢叶酸为原料合成甘氨酸。
[0004]甘氨酸裂解酶系由H，P，T，L四个蛋白组成，协同发挥作用。其中H蛋白作为组内的穿梭蛋白，以其硫辛酸臂连接其它三个功能蛋白的反应活性位点，进行循环反应。在代谢网络中，GCS是丝氨酸、甘氨酸、一碳单元代谢的重要组成部分，与肿瘤细胞生长、人类高甘氨酸血症、植物的光呼吸有密切关系。
[0005]我们通过对GCS反应机理进行研究，发现H
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蛋白上关键氨基酸残基的突变可以影响GCS的活力，通过H
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蛋白定向改造，可以显著提高或降低GCS的活力，进而定量可控的调节甘氨酸的合成及分解，这在肿瘤及神经性疾病治疗和植物抗衰老抗逆方面都有广阔的应用前景。

技术实现思路
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[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术通过对甘氨酸裂解酶系的理性设计，提出一种改变甘氨酸裂解酶系酶活的突变策略，使得甘氨酸裂解酶系的酶活得到显著提高，从而促进了碳一合成路径的效率，有效提高了下游高附加值产物的产量；或使得酶活得到降低，进一步调控产物的合成。
[0007]本专利技术实现上述目的所采用的技术方案之一，是提供一种H
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蛋白突变体，所述突变体是在SEQ ID NO.1(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)所示的H
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蛋白原始序列上，发生了以下位点中的至少一个突变：
[0008]第12位的赖氨酸Lys(K)；第35位的谷氨酸Glu(E)；第68位的丝氨酸Ser(S)；第69位的天冬氨酸Asp(D)；或第71位的酪氨酸Tyr(Y)；
[0009]进一步地，第12位的赖氨酸Lys(K)突变为Ala(A)、Ser(S)、Asp(D)、Val(V)Thr(T)或Ile(I)；
[0010]进一步地，第35位的谷氨酸Glu(E)突变为Ala(A)、Ser(S)、Asp(D)、Val(V)Phe(F)或Arg(R)；
[0011]进一步地，第68位的丝氨酸Ser(S)突变为Cys(C)、Thr(T)、Val(V)、Pro(P)、Asp
(D)、Trp(W)、Gly(G)或Ile(I)；
[0012]进一步地，第69位的天冬氨酸Asp(D)突变为Arg(R)、Leu(L)、Glu(E)、His(H)、Tyr(Y)、Lys(K)、Ile(I)、Thr(T)、Trp(W)、Met(M)、Val(V)、Cys(C)或Gly(G)；
[0013]进一步地，第71位的酪氨酸Tyr(Y)突变为Gly(G)、Ile(I)、Ala(A)、Ser(S)、Arg(R)、Val(V)、Phe(F)、Leu(L)、His(H)、Thr(T)、Trp(W)、Lys(K)或Met(M)。
[0014]SEQ ID NO.1:
[0015]MSNVPAELKYSKEHEWLRKEADGTYTVGITEHAQELLGDMVFVDLPEVGATVSAGDDCAVAESVKAASDIYAPVSGEIVAVNDALSDSPELVNSEPYAGGWIFKIKASDESELESLLDATAYEALLEDE.
[0016]SEQ ID NO.2
[0017]ATGGGCAGCAACGTACCAGCAGAACTGAAATACAGCAAAGAACACGAATGGCTGCGTAAAGAAGCCGACGGCACTTACACCGTTGGTATTACCGAACATGCTCAGGAGCTGTTAGGCGATATGGTGTTTGTTGACCTGCCGGAAGTGGGCGCAACGGTTAGCGCGGGCGATGACTGCGCGGTTGCCGAATCAGTAAAAGCGGCGTCAGACATTTATGCGCCAGTAAGCGGTGAAATCGTGGCGGTAAACGACGCACTGAGCGATTCCCCGGAACTGGTGAACAGCGAACCGTATGCAGGTGGCTGGATCTTTAAAATCAAAGCCAGCGATGAAAGCGAACTGGAATCACTGCTGGATGCGACCGCATACGAAGCATTGTTAGAAGACGAG.
[0018]本专利技术还提供上述突变体的编码基因。
[0019]本专利技术还提供含有上述突变体编码基因的重组载体或重组菌株。
[0020]进一步地，所述重组载体采用的表达载体为pET
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28a，pET
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21a或pET
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32a；
[0021]优选地，所述表达载体为pET
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28a；
[0022]进一步地，所述重组菌株采用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109(DE3)；
[0023]优选地，所述宿主为BL21(DE3)。
[0024]本专利技术还提供上述重组载体或重组菌株在制备H蛋白中的应用。
[0025]本专利技术还提供上述突变体在甘氨酸裂解及合成中的应用。
[0026]有益效果：
[0027]本专利技术通过对甘氨酸裂解酶系蛋白间反应机理的揭示，首次从蛋白质理性设计的角度，自上而下提出一种改变甘氨酸裂解酶系酶活的突变策略。其中涉及到的突变位点，部分能有效提高碳一合成路径的效率，这不仅能够提高上游对二氧化碳的吸收利用，同时能够促进下游的循环发展，对癌症，以及肥胖的治疗都具有积极的作用；部分能有效的降低合成效率起到调控作用。
具体实施方式：
[0028]下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。
[0029]本专利技术以来自大肠杆菌的野生型H
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蛋白为基础(SEQ ID NO.1所示)，通过定点突变技术获得一系列H
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蛋白突变体及其编码基因，该定点突变的过程为：
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种H
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蛋白，其特征在于，所述H
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蛋白是在SEQ ID NO.1所示的野生型H
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蛋白的基础上，将第71位的酪氨酸Tyr(Y)突变为Gly(G)、Ile(I)、Ala(A)、Ser(S)、Arg(R)、Val(V)、Phe(F)或Leu(L)、His(H)、Thr...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾安平，张涵，任杰，许颖颖，李宇辰，聂晶磊，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：