本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种耐热碱性果胶酶及其制备。本发明专利技术通过PCR获得来自枯草芽孢杆菌突变菌的耐热碱性果胶酶突变基因A
【技术实现步骤摘要】
一种耐热碱性果胶酶突变体及其制备与应用
：
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种耐热碱性果胶酶及其制备与应用。
技术介绍
：
[0002]果胶酶(Pectinases)包括聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶(PE)、果胶裂解酶(PL)等主要组分，是最早得到应用的酶类之一。到了五十年代，果胶酶制剂开始规模化生产。它在食品工业、麻料脱胶、木材防腐方面有着重要的价值。果胶酶源自各种生物，微生物因生长速度快，生长条件简单和分布广泛等优势成为果胶酶的重要来源。
[0003]果胶酶按其作用的最适pH值，分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。碱性果胶酶酶来源较广，普遍存在于细菌、酵母菌、霉菌、植物和某些寄生线虫体内。来源于不同微生物的碱性果胶酶生物、理化性质也不同，微生物来源的原果胶酶、果胶醋酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶的最适pH有偏酸的、也有偏碱的，而果胶酸裂解酶则全部属于碱性果胶酶。真菌来源的果胶酶较细菌来源的偏酸。自1972年日本学者Koki Horikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来，至今已分离鉴定出几十种碱性果胶酶，但其中能应用于工业化生产的为数不多。碱性果胶酶广泛应用于食品、纺织、造纸、环境、生物技术等各个领域，在茶和咖啡发酵、纺织和植物纤维加工、油提取、含果胶工业废水处理等发挥巨大作用。
[0004]碱性果胶酶可以作为新型生物防预农药，因其可降解寄主组织的果胶质产生寡聚糖片段；在纺织工业中，用碱性果胶酶代替碱，对棉、麻等织物进行煮练加工和整理工艺；在造纸行业中，真叶木原料中释放的溶解性胶体物质会严重影响过滤，果胶酶可以降解果胶或聚半乳糖酸，提高纸的质量；利用果胶酶还可以处理柑橘加工和蔬菜加工过程中产生的大量含果胶的废水，传统方法成本高、处理时间长，碱性果胶酶克服了以上缺点，成本低、效果好且不产生二次污染。
[0005]目前，碱性果胶酶工业化生产中主要存在以下问题：生产的碱性果胶酶本身活力不高；碱性果胶酶的工业化生产工艺技术不成熟。以上问题导致碱性果胶酶的生产成本过高。为了使碱性果胶酶在工业上有更加广泛的应用，筛选新型碱性果胶酶并构建高产菌株是本专利技术所解决的重点问题。
技术实现思路
：
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供一种耐热性提高的果胶酶突变体，所述果胶酶突变体具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
[0007]所述果胶酶突变体来自一株经紫外诱变获得的枯草芽孢杆菌(BS
‑
5)，经诱变后，野生型枯草芽孢杆菌中的果胶酶发生Phe166Leu和Gly195Ala突变；
[0008]进一步地，所述果胶酶突变体具有如下酶学性质：
[0009](1)碱性果胶酶的作用温度范围40
‑
60℃，最适作用温度为55℃，在温度40℃、60℃下较55℃有70％以上作用效果；
[0010](2)pH为9.0为酶的最适作用pH，在pH8.0、10.0下较pH9.0仍有70％以上酶作用效
果；
[0011](3)碱性果胶酶突变体在70℃条件下保温2h仍能维持80％的酶活性，在80℃条件下保温2h仍能维持70％的酶活性，而野生型剩余酶活低于50％，表明果胶酶突变体具有相当高的热稳定性。
[0012]进一步地，所述果胶酶突变体的编码基因A
‑
2，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
[0013]本专利技术还提供包含上述编码基因A
‑
2的重组质粒或重组菌株；
[0014]进一步地，所述重组质粒所采用的表达载体为pPIC9质粒；
[0015]进一步地，所述重组菌株所采用的宿主细胞为毕赤酵母GS115。
[0016]本专利技术还提供上述重组质粒或重组菌株在制备果胶酶中的应用。
[0017]有益效果：
[0018]1、本专利技术提供了一种全新的碱性果胶酶突变体，该突变体具有酶活高，热稳定性好的特点。该突变体摇瓶发酵液酶活可达359U/mL，较原始碱性果胶酶提高200％；
[0019]2、本专利技术获得的碱性果胶酶热稳定性好，在70℃条件下保温2h仍能维持80％的酶活性，在80℃时，仍保留70％以上的活性。
附图说明：
[0020]图1菌落PCR鉴定电泳图；
[0021]图2碱性果胶酶最适作用温度图；
[0022]图3碱性果胶酶最适作用pH图；
[0023]图4碱性果胶酶温度稳定性曲线。
具体实施方式：
[0024]通过具体实施例对本专利技术作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本专利技术实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本专利技术原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本专利技术保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。
[0025]本专利技术采用的碱性果胶酶活力测定方法如下：
[0026]将发酵液在4℃，12000rpm的高速冷冻离心机上离心5min，取上清液制成酶液测定酶活力。方法：取1ml酶液和2ml的1％(w/v)果胶(pH9.0缓冲液配制)溶液分别置于两个试管中，于45℃水浴预热5min，再使它们充分混合，准确反应10min，取上述混合物1ml加入9ml 0.01mol/L HCl终止反应，在235nm处测定吸光值，以灭过酶活的酶液作为空白对照。
[0027]1个标准酶活力单位定义为：在一定条件下(如未特别说明，所述条件为45℃，pH9.0)，每分钟裂解果胶产生1μmol不饱和半乳糖酸的酶量。不饱和半乳糖酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600mol/(L
·
cm)。
[0028]酶活力：U＝A
×
n
×
30/46
[0029]式中：U—酶液的酶活力，单位为U/mL；A—OD
235
；n—酶液稀释倍数。
[0030]本专利技术所采用的果胶酶突变体的标识：
[0031]采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如
Phe166Leu，表示位置166的氨基酸由野生型的Phe替换成Leu，位置的编号对应于SEQ ID No.2中野生型碱性果胶酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQ ID No.1中野生型碱性果胶酶的核苷酸序列编号。
[0032]在本专利技术中，A
‑
1表示野生型碱性果胶酶的编码基因，A
‑
2表示碱性果胶酶突变体的编码基因，信息如下表。
[0033][0034]本专利技术涉及菌株的诱变筛选过程如下：
[0035]菌悬液制备：将处在生长旺盛阶段的原始菌株枯草芽孢杆菌(BS)采用0.9％的生理盐水，35℃振荡30min，配成均匀的菌悬液。
[0036]紫外诱变：菌悬液置于紫外灯下25cm照射处理100s。照射后的菌株悬液依次稀释至10
‑4、10
‑5、10...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种碱性果胶酶突变体，其特征在于，具有序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述碱性果胶酶突变体的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。4.包含权利要求2或3所述编码基因的重组质粒或重组菌株。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：王兴吉，王克芬，王帅，郭庆文，张杰，刘胜利，王路路，
申请(专利权)人：济南正隆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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