产透明质酸菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及一株产透明质酸菌株及其在发酵生产透明质酸中的应用。本发明专利技术通过自然选育和诱变育种相结合的方法筛选得到一株高产透明质酸的兽疫链球菌HEC

【技术实现步骤摘要】
产透明质酸菌株及其应用


[0001]本专利技术属于微生物
，具体涉及到一株产透明质酸菌株，及其在发酵生产透明质酸的应用。

技术介绍

[0002]透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。发酵法生产透明质酸具有原料易得、产量高、成本低廉的优势，因此逐渐成为当今透明质酸生产的主要方式。采用发酵法高产透明质酸常常与菌株特性、发酵工艺等因素有关，其中，菌株特性往往起到至关重要的作用。为了获得一株特性优良、高产的宿主，通常需要经过从自然界多次分离和反复诱变、驯化才能获得。目前，链球菌属的A类和C类都可以用于生产透明质酸，尤其是C类的兽疫链球菌，由于其生产的透明质酸分子量大、产量相对较高、对人潜在危害较低而受到更多的关注。但是，以目前现有报导的兽疫链球菌的透明质酸产量来看，还难以满足市场的需求。

技术实现思路

[0003]本专利技术是基于专利技术人对以下问题的认识和发现所作出的:
[0004]目前所报道的野生型兽疫链球菌菌株在摇瓶水平的透明质酸产量一般为0.1-0.7g/L，发酵罐产量一般在6g/L。
[0005]为此，本专利技术的目的是为了提供一株透明质酸产量高的菌株。
[0006]同时，本专利技术提供了所述产透明质酸菌株的育种方法。
[0007]其次本专利技术还提供一种通过分子生物学和革兰氏染色鉴定所述菌株的方法。
[0008]再者，本专利技术提供了所述菌株在生产透明质酸中的应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0010]一株产透明质酸菌株，为兽疫链球菌Streptococcus equisubsp.zooepidemicusHEC-SE01，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2020231，保藏日期：2020年06月22日。
[0011]所述兽疫链球菌HEC-SE01是从牛鼻粘膜内侧取样通过自然选育和诱变育种相结合的方法获得。
[0012]所述兽疫链球菌HEC-SE01基因组上16S rDNA具有SEQ ID NO:1序列区段。
[0013]本专利技术还提供了一种鉴定兽疫链球菌HEC-SE01的方法，包括16S rDNA基因序列分析和革兰氏染色。
[0014]本专利技术还提供了所述兽疫链球菌HEC-SE01在发酵生产透明质酸中的应用，即将兽
疫链球菌HEC-SE01接种于发酵培养基中进行发酵培养，接种量为8-12％。
[0015]在一些实施例中，接种量为10％。
[0016]在一些实施例中，所述发酵培养条件为37℃，220rpm，发酵45-50h。
[0017]在一些实施例中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖30-50g/L，酵母粉3-7g/L，蛋白胨12-18g/L，K2HPO
4 1-3g/L，MgSO
4 0.2-0.5g/L，味精1-5g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，并调节pH＝7.5。
[0018]根据本专利技术的具体实施例，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖30g/L，酵母粉5.55g/L，蛋白胨16.67g/L，K2HPO
4 1.72g/L，MgSO
4 0.36g/L，味精3.4g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，并调节pH＝7.5。
[0019]在一些实施例中，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖70-90g/L，蛋白胨14-20g/L，酵母粉3-7g/L,K2HPO
4 1-3g/L,味精2-5g/L，MgSO
4 0.4-0.9g/L。
[0020]具体地，在发酵期间通过流加NaOH调节pH维持在7.0。
[0021]在一些实施例中，所述兽疫链球菌HEC-SE01在发酵生产透明质酸中的应用，还包括将所述兽疫链球菌HEC-SE01接种于种子培养基中进行种子液培养。
[0022]在一些实施例中，所述种子培养基包括葡萄糖8-12g/L，蛋白胨13-17g/L，酵母浸粉3-7g/L，K2HPO
4 1-2g/L，MgSO
4 0.3-0.4g/L，调节pH 6.3-6.8。
[0023]根据本专利技术具体的实施例，所述种子培养基包括葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，K2HPO
4 1.5g/L，MgSO
4 0.35g/L，调节pH 6.5。
[0024]本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
[0025]本专利技术通过自然选育和诱变育种相结合的方法获得了一株高产透明质酸的兽疫链球菌菌株，经摇瓶验证，透明质酸产量高达0.8-0.9g/L，分子量在200-300WDa，15L发酵罐放大实验得到7-8g/L的透明质酸产率，高于目前大多数兽疫链球菌的产能，具有很大的生产潜力。
附图说明
[0026]图1为根据本专利技术实施例的S2菌株的革兰氏染色镜检图。
[0027]图2为根据本专利技术实施例的S2菌株在不同ARTP诱变时间下的致死率。
具体实施方式
[0028]下面的实施例对本专利技术作详细说明，应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术要求保护的范围。
[0029]实施例1：产透明质酸菌株的筛选
[0030]从市场采购一些新鲜的牛鼻，对其外围裸露部分进行消毒清洁；用棉签擦拭牛鼻内侧，并用无菌剪刀将棉签头剪下，放入BHI液体培养基中，37℃，220rpm培养12-18h。根据培养基的浑浊程度，将其稀释至10-3
、10-4
和10-5
，分别取100μL涂布于BHI固体培养基上，37℃培养24h，表观观察单菌落的形态、粘度等，初步筛选出颜色灰白、表面光滑湿润、圆形凸起的菌落，用枪尖挑起有明显粘滞感的菌落共计20株备用，并标记为F1-F20。
[0031]实施例2血平板复筛
[0032]分别挑取F1-F20单菌落在血平板上进行划线扩培，37℃恒温培养48h，观察血平板
上的溶血情况。挑取周围出现明显透明圈的、菌落较大、生长旺盛、用枪尖挑起有明显粘滞感的菌落作为候选菌株，共计6株，并分别编号S1-S6。
[0033]实施例3候选菌株产透明质酸能力考察
[0034]挑取S1-S6单菌落接种至BHI液体培养基中37℃，220rpm扩培24h，按照0.1％接种量转接到种子培养基中，37℃，220rpm培养12h；按照10％的接种量转接到发酵培养基中，37℃，220rpm发酵48h，取样进行GPC检测，透明质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产透明质酸的菌株，其特征在于，所述菌株为兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)HEC-SE01，保藏号为CCTCC NO:M 2020231。2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株基因组上16S rDNA具有SEQ ID NO:3序列区段。3.一种根据权利要求1所述菌株的鉴定方法，其特征在于，利用16S rDNA基因序列分析和革兰氏染色，鉴定菌株的确切种属。4.权利要求1所述菌株在发酵生产透明质酸中的应用，其特征在于，将兽疫链球菌HEC-SE01按8-12％接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养；任选地，接种量为10％。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养条件为37℃，220rpm，发酵45-50h。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖30-50g/L，酵母粉3-7g/L，蛋白胨12-18g/L，K2HPO
4 1-3g/L，MgSO
4 0.2-0.5g/L，味精1-5g/L，无水磷酸二氢钠9.36g/L，十二水合磷酸氢二钠43.69g/L，pH＝7.5；任选地，所述发酵培养基包括葡萄糖30g/L，酵母粉5.55g...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凯峰，谭秀梅，鲍素敏，石江水，谢文平，
申请(专利权)人：宜昌东阳光生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：