兽疫链球菌的基因工程菌株及其应用制造技术

本发明专利技术提出了一种兽疫链球菌的基因工程菌株。所述基因工程菌株携带外源的基因表达框，所述外源的基因表达框包括第一基因表达框和第二基因表达框，其中，所述第一基因表达框包括第一启动子和hasA基因，所述第一启动子和hasA基因可操作的连接；所述第二基因表达框包括第二启动子和hasB基因，所述第二启动子和hasB基因可操作的连接。根据本发明专利技术实施例的兽疫链球菌的基因工程菌株，携带外源的hasA基因表达框和外源的hasB基因表达框，而不携带外源的hasC基因表达框，外源的基因表达框中的hasA基因和hasB基因在两个独立地启动子下启动表达，相比于现有兽疫链球菌的基因工程菌株，具有显著更高的HA合成产量。有显著更高的HA合成产量。

【技术实现步骤摘要】
兽疫链球菌的基因工程菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及兽疫链球菌的基因工程菌株及其应用，更具体地，本专利技术涉及兽疫链球菌的基因工程菌株、提高兽疫链球菌合成透明质酸的方法以及生产透明质酸的方法。

技术介绍

[0002]透明质酸(hyaluronic acid或hyaluronan,HA)是由葡萄糖醛酸和氨基葡糖的双糖重复单位所组成的多糖，广泛分布于软骨组织、关节液和皮肤组织的真皮以及表皮中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸的生产方法有动物组织提取法和发酵法，由于动物组织提取法的制备成本高，分离纯化复杂，逐渐被发酵法所取代。
[0003]由于发酵方法简单，所需原料易得，成本相对较低，微生物发酵法生产透明质酸是当前生产透明质酸最主要的方式之一。目前可用于直接生产HA的微生物菌株主要分为链球菌属中的A类和C类，如酿脓链球菌和兽疫链球菌等。兽疫链球菌作为C类链球菌中的一员，由于其更低的致病性，更高的HA产率而常常受到青睐。然而，利用微生物发酵法生产HA也体现出许多局限。受宿主菌的影响，不同宿主生产HA的能力不同，但摇瓶产量大多小于1g/L，发酵罐产量也一般在7g/L以内，这不但增加了生产成本，也难以满足日益增长的市场需求。以目前的宿主改良技术而言，化学诱变或物理诱变技术是筛选优良生产菌株的主流方式之一，但诱变育种周期较长、结果不确定性大、高毒性的弊端也常常是限制其发展的主要因素之一。
[0004]相比诱变育种而言，利用基因工程手段来定向改造宿主，从而获得高产菌株的手段具有更快捷、更可控、周期短的优势，是当前及未来最主要的育种技术之一。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0006]本申请的专利技术人在研发过程中意外地发现，hasB基因在兽疫链球菌生产透明质酸中的作用尤其显著，并且本申请的专利技术人独创性地将hasAB拆分成两个独立完成的表达框，并将hasB基因的稀有起始密码子GTG突变成ATG，增强了hasB基因的表达比例，最终使摇瓶发酵产量达到2.4-2.8g/L，相比野生型兽疫链球菌生产透明质酸的产量0.8g/L-0.9g/L，产量提高了160％以上。
[0007]在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种兽疫链球菌的基因工程菌株。根据本专利技术的实施例，所述基因工程菌株携带外源的基因表达框，所述外源的基因表达框包括第一基因表达框和第二基因表达框，其中，所述第一基因表达框包括第一启动子和hasA基因，所述第一启动子和hasA基因可操作的连接；所述第二基因表达框包括第二启动子和hasB基因，所述第二启动子和hasB基因可操作的连接。需要说明的是，本申请所述的“外源的基因表达框”是指来源于外部的基因表达框，而非兽疫链球菌自身基因组上具有的基因表达框，这种来源于外部的基因表达框可通过构建体或载体携带所需的基因表达框进入兽疫链球
菌菌体内获得，它的结构可以与兽疫链球菌自身基因组上具有的基因表达框相同或不同。根据本专利技术实施例的兽疫链球菌的基因工程菌株，携带外源的hasA基因表达框和外源的hasB 基因表达框，而不携带外源的hasC基因表达框，且外源的基因表达框中的hasA基因和hasB 基因可在两个独立地启动子下启动表达，相比于现有兽疫链球菌的基因工程菌株，具有显著更高的HA合成产量。
[0008]根据本专利技术的实施例，上述兽疫链球菌的基因工程菌株还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
[0009]根据本专利技术的实施例，所述第一基因表达框和第二基因表达框设置于不同的构建体或同一构建体上。
[0010]根据本专利技术的实施例，所述构建体包括选自pSET4、pSET4s、pEU308、pDL276的至少之一。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述第一基因表达框和第二基因表达框设置于同一构建体上，所述第一基因表达框的3
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端与所述第二基因表达框的5
’
端相连或所述第二基因表达框的 3
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端与所述第一基因表达框的5
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端相连。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述构建体为游离型pSET4载体。根据本专利技术实施例的游离型 pSET4载体稳定性更高。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述第一启动子启动基因表达的强度弱于所述第二启动子启动基因表达的强度。专利技术人发现，当控制hasA基因的第一启动子的强度弱于控制hasB基因的第二启动子的强度时，根据本专利技术实施例的兽疫链球菌的基因工程菌株的HA合成产量更高。例如，专利技术人尝试当采用Pldh控制hasA基因，PABC控制hasB基因,PABC启动子的强度弱于Pldh启动子，或者是同时采用Pldh控制hasA基因和hasB基因，所获得的HA 的产量均低于采用PABC控制hasA基因，Pldh控制hasA基因。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述第一启动子和第二启动子分别独立地选自PGAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子)、PacK(乙酸激酶启动子)、PABC或Pldh。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述第一启动子为PABC，所述第二启动子为Pldh。专利技术人发现，hasB基因在兽疫链球菌生产透明质酸中的作用尤其显著，采用和乳酸脱氢酶相同的启动子Pldh来表达hasB基因，通过启动子竞争机制明显降低发酵过程中乳酸的生成，使发酵过程更容易控制。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述hasB基因的起始密码子为ATG。专利技术人发现，将hasB基因的GTG起始密码子更改成ATG起始密码子，可进一步提升hasB基因的表达比例，进一步提高HA合成产量。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述兽疫链球菌的分类命名为Streptococcus equisubsp.zooepidemicus HEC-SE01,马链球菌兽疫亚种HEC-SE01，保藏号为CCTCC NO:M 2020231，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年6月22日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
[0018]在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种提高兽疫链球菌合成透明质酸的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括使得兽疫链球菌携带外源的基因表达框，所述外源的基因表达框包括第一基因表达框和第二基因表达框，其中，所述第一基因表达框包括第一启动子和hasA基因，所述第一启动子和hasA基因可操作的连接；所述第二基因表达框包括
第二启动子和hasB基因，所述第二启动子和hasB基因可操作的连接。根据本专利技术实施例的方法可显著提高透明质酸的合成量。
[0019]根据本专利技术实施例的方法具有与上述兽疫链球菌基因工程菌株相同的附加技术特征，所带来的技术效果相同，在此不再赘述。
[0020]根据本专利技术的具体实施例，使得兽疫链球菌携带外源的基因表达框是通过将携带所需基因表达框的构建体通过电穿孔法导入兽疫链球菌实现的。
[0021]在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种生产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种兽疫链球菌的基因工程菌株，其特征在于，携带外源的基因表达框，所述外源的基因表达框包括第一基因表达框和第二基因表达框，其中，所述第一基因表达框包括第一启动子和hasA基因，所述第一启动子和hasA基因可操作的连接；所述第二基因表达框包括第二启动子和hasB基因，所述第二启动子和hasB基因可操作的连接。2.根据权利要求1所述基因工程菌株，其特征在于，所述第一基因表达框和第二基因表达框设置于不同的构建体或同一构建体上；任选地，所述构建体包括选自pSET4、pSET4s、pEU308、pDL276至少之一；任选地，所述第一基因表达框和第二基因表达框设置于同一构建体上，所述第一基因表达框的3
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端与所述第二基因表达框的5
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端相连或所述第二基因表达框的3
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端与所述第一基因表达框的5
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端相连。3.根据权利要求2所述的基因工程菌株，其特征在于，所述构建体为游离型pSET4载体。4.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述第一启动子启动基因表达的强度弱于所述第二启动子启动基因表达的强度。5.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述第一启动子和第二启动子分别独立地选自PGAPDH、PacK、PABC或Pldh；优选地，所述第一启动子为PABC，所述第二启动子为Pldh。6.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述hasB基因的起始密码子为ATG。7.根据权利要求1所述的基因工程菌株，其特征在于，所述兽疫链球菌的保藏号为CCTCC NO:M ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凯峰，谭秀梅，鲍素敏，石江水，谢文平，徐宇骋，肖文龙，马雷磊，
申请(专利权)人：宜昌东阳光生化制药有限公司，
类型：发明
国别省市：