棒状链霉菌制造技术

本发明专利技术涉及一种棒状链霉菌菌株，其包含ccaR启动子区中的两个点突变和ccaR基因中的一个取代突变，其中ccaR启动子区中的突变为与SEQ ID NO：1的第48位对应的位点处的C到T点突变和与SEQ ID NO：1的第143位对应的位点处的G到A点突变；并且其中ccaR基因中的突变是与SEQ ID NO：2的第32位对应的位点处的精氨酸到色氨酸取代。本发明专利技术还涉及使用所述棒状链霉菌菌株制备棒酸的方法。制备棒酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】棒状链霉菌


[0001]本专利技术总体上涉及棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中棒酸产量的提升。特别地，本专利技术提供了在ccaR启动子区和基因中包含点突变的棒状链霉菌、包含含有所述突变的ccaR启动子区和基因以用于产生所述棒状链霉菌的载体以及使用所述棒状链霉菌产生棒酸的方法，以及使用所述棒状链霉菌产生的棒酸制备的药物制剂。
[0002]专利技术背景
[0003]β
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内酰胺类抗生素，如青霉素，是使用最广泛的一类抗生素(Bush&Bradford(2016)Cold Spring Harb Perspect Med)。然而，某些病原体通过产生β
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内酰胺酶而对β
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内酰胺类抗生素产生耐药性，从而降低了β
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内酰胺类抗生素的有效性。
[0004]棒酸是一种β
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内酰胺化合物，在结构上与青霉素相关，由棒状链霉菌作为发酵产物产生。棒酸是从棒状链霉菌中分离出来的，在1976年被Reading和Cole鉴定为一种新型的β
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内酰胺酶抑制剂(Reading&Cole,(1977)Antimicrob.Agents Chemother.)。棒酸的添加显示出增强β
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内酰胺酶不稳定性抗生素的抗菌活性。
[0005]从那时起，棒酸与β
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内酰胺类抗生素在制药工业中被广泛用于治疗由产生β
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内酰胺酶的病原体引起的感染，这些病原体原本将对β
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内酰胺类抗生素产生抗药性。据了解，棒酸的β
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内酰胺结构代替β
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内酰胺类抗生素与病原体产生的β
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内酰胺酶的活性位点结合，对酶产生不可逆的抑制作用(Labia and Peduzzi,(1985)Drugs Exp.Clin.Res；Georgopapadkou(2004)Exp.Opin.Investig.Drugs)。
[0006]棒状链霉菌菌株的改良对棒酸工业发酵过程中降低生产成本具有重要作用。传统上，在工业发酵中获得更高产量的棒酸的菌株改良策略很大程度上取决于随机诱变和选择技术。然而，随着对棒状链霉菌产生棒酸的关键生物合成途径和调控机制的了解增加，菌株改良策略也与基于知识的合理方法相结合(Paradkar(2013)The Journal of Antibiotics)。
[0007]因此，对开发产生更高产量的棒酸的额外棒状链霉菌菌株和使用这些菌株以更低的成本产生更高产量的棒酸的改进方法存在持续需要。
[0008]专利技术概述
[0009]令人惊讶的是，专利技术人发现与野生型(WT)棒状链霉菌相比，在ccaR启动子区和ccaR基因中包含突变的棒状链霉菌菌株以更快的速率产生更高滴度的棒酸。本公开将使得用于产生棒酸的改进方法成为可能，与野生型棒状链霉菌相比，特别是在工业规模下，该方法以更低的成本生产更高滴度的棒酸。
[0010]根据本专利技术的第一方面，提供了一种在ccaR启动子区包含两个点突变和在ccaR基因中包含一个取代突变的棒状链霉菌，其中ccaR启动子区中的点突变为与SEQ ID NO：1的第48位对应的位点处的C(胞嘧啶)到T(胸腺嘧啶)突变和与SEQ ID NO：1的第143位对应的位点处的G(鸟嘌呤)到A(腺嘌呤)点突变；并且其中ccaR基因中的突变是与SEQ ID NO：2的第32位对应的位点处的精氨酸到色氨酸取代。
[0011]根据本专利技术的另一方面，提供了用于产生棒酸的本专利技术的棒状链霉菌。
[0012]根据本专利技术的另一方面，提供了包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含含有两个点突变的ccaR启动子区和含有一个取代突变的ccaR基因，其中ccaR启动子区中的点突变为与SEQ ID NO：1的第48位对应的位点处的C到T突变和与SEQ ID NO：1的第143位对应的位点处的G到A突变；并且其中ccaR基因中的取代突变是与SEQ ID NO：2的第32位对应的位点处的精氨酸至色氨酸取代。
[0013]根据本专利技术的又一方面，提供了一种产生棒酸的方法，其包括使本专利技术的棒状链霉菌生长和回收由所述棒状链霉菌或其子代产生的棒酸的步骤。
[0014]根据本专利技术的另一方面，提供了一种产生包含β
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内酰胺类抗生素和棒酸的药物制剂的方法，该方法包括以下步骤：(a)使本专利技术的棒状链霉菌生长；(b)回收由所述棒状链霉菌或其子代产生的棒酸；和(c)将步骤(b)中回收的棒酸与β
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内酰胺类抗生素组合，以制备药物制剂。
附图说明
[0015]图1：组合的ccaR突变M1、M2和M3对发酵的影响：棒酸滴度曲线
[0016]图2：ccaR突变的影响：65小时时的发酵滴度
[0017]图3：ccaR突变对发酵的影响：棒酸滴度曲线
[0018]图4：组合的ccaR突变M1、M2和M3对发酵粘度曲线的影响
[0019]图5：ccaR突变对发酵粘度曲线的影响
[0020]专利技术详述
[0021]本专利技术通过在ccaR启动子区和基因中引入突变，对使用棒状链霉菌产生棒酸的方法提供了显著改进。由本专利技术的棒状链霉菌菌株产生的棒酸可以与β
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内酰胺类抗生素如阿莫西林组合，以产生AUGMENTIN。
[0022]棒酸的生物合成可分为早期和晚期合成，因此，根据其功能，参与棒酸合成的基因也可分为早期和晚期基因。
[0023]棒状链霉菌ccaR基因位于头霉素C基因簇内，并且位于blp基因的上游(Perez
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Llarena等(1997)J.Bacteriol.)。ccaR启动子区、ccaR基因和关联的blp基因的核苷酸序列可在GenBank上获得(登录号Z81324)。
[0024]ccaR基因编码正向作用转录调节因子CcaR，其控制棒酸和头霉素C的产生(Alexander&Jensen(1998)J.Bacteriol.；Santamarta等人(2011)Mol.Microbiol.)。棒酸和头霉素C的产生在棒状链霉菌ccaR敲除突变体中消失，并在重新引入野生型ccaR后恢复，这表明CcaR正向调节这两种蛋白质的产生。
[0025]CcaR直接和间接调节棒酸的产生。通过调节ceaS2
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bls
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pah
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cas2多顺反子转录物的表达直接调节，其产物参与导致棒胺酸(clavaminic acid)形成的“早期”反应途径。通过调节claR的表达间接调节，这反过来调节参与将棒胺酸转化为棒酸的“晚期”反应途径的基因的表达。此外，CcaR显示出结合至ccaR的上游并自动调节其自身的表达。
[0026]专利技术人已经鉴定了如下所述的ccaR启动子区和基因内的三个突变，以用于开发改进的棒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.棒状链霉菌，其包含ccaR启动子区中的两个点突变和ccaR基因中的取代突变，其中所述ccaR启动子区中的点突变为与SEQ ID NO：1的第48位对应的位点处的C到T点突变和与SEQ ID NO：1的第143位对应的位点处的G到A点突变；并且其中所述ccaR基因中的取代突变是与SEQ ID NO：2的第32位对应的位点处的精氨酸到色氨酸取代。2.根据权利要求1的棒状链霉菌，其中所述精氨酸到色氨酸取代是由与SEQ ID NO：1的第344位对应的位点处的C到T点突变导致的结果。3.根据权利要求1或2的棒状链霉菌，其包含SEQ ID NO：3的核酸序列。4.根据前述权利要求中任一项的棒状链霉菌，其能够产生约0.5g/L或更高、约1g/L或更高、约1.5g/L或更高、约2g/L或更高或约2.5g/L或更高滴度的棒酸。5.根据前述权利要求中任一项的棒状链霉菌，其能够产生约2.1g/L或更高滴度的棒酸。6.根据权利要求4或5的棒状链霉菌，其中所述棒酸的滴度在发酵65小时后产生。7.根据权利要求1至6中任一项的棒状链霉菌，其与野生型(WT)棒状链霉菌相比，在发酵65小时后，能够产生约100％或更高、约200％或更高、约300％或更高、约400％或更高、约500％或更高、约600％或更高、约700％或更高、约800％或更高、约900％或更高、或约1000％或更高滴度的棒酸。8.根据权利要求1至6中任一项的棒状链霉菌，其与WT棒状链霉菌相比，在发酵65小时后，能够产生约1000％或更高滴度的棒酸。9.根据前述权利要求中任一项的棒状链霉菌，其与野生型(WT)棒状链霉菌相比，在发酵65小时后，能够使发酵液的粘度降低约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约35％或更多、或约40％或更多。10.根据权利要求9的棒状链霉菌，其与WT棒状链霉菌相比，在发酵65小时后，能够使发酵液的粘度降低约40％或更多。11.根据前述权利要求中任一项的棒状链霉菌，其用于产生棒酸。12.包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含含有两个点突变的ccaR启动子区和含有取代突变的ccaR基因，其中所述ccaR启动子区中的点突变为与SEQ ID NO：1的第48位对应的位点处的C到T突变和与SEQ ID NO：1的第143位对应的位点处的G到A突变；并且其中所述ccaR基因中的取代突...

【专利技术属性】
技术研发人员：AJ科利斯，N克劳赫斯特，KJ霍尼克，SG肯德鲁，
申请(专利权)人：葛兰素史密斯克莱知识产权第二号有限公司，
类型：发明
国别省市：