甘氨酸的生产方法技术

本发明专利技术公开了甘氨酸的生产方法。本发明专利技术提供了一种构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法，包括如下步骤：使受体菌表达来源于耻垢分枝杆菌、少盐芽孢杆菌、结核分支杆菌、海水芽孢杆菌、玻利维亚盐单胞菌、维氏气单胞菌或团聚拉布伦茨氏菌的乙醛酸氨化酶，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产甘氨酸的工程菌株。本发明专利技术开辟了利用生物法合成甘氨酸的先河。河。

【技术实现步骤摘要】
甘氨酸的生产方法


[0001]本专利技术涉及本专利技术涉及生物
，特别涉及一种甘氨酸的生产方法。

技术介绍

[0002]甘氨酸(glycine)是氨基酸系列中结构最为简单，人体非必须氨基酸。作为一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、食品和饲料添加剂领域。在食品中添加甘氨酸可以用作食品的防腐剂，延长其保质期；在含酒精饮料和动植物食品的加工中，则作为调味剂，增香剂。在医药方面，甘氨酸可以合成多种药物，如治疗高血压药物盐酸地拉普利、抑制胃溃疡用碳酸钙制剂、扑热息痛甘氨酸盐、单甘氨酸乙酰水杨酸钙、利血胺注射液、抗帕金森氏药物L-多巴、甲砜霉素等。工业级甘氨酸则主要用于大规模生产除草活性最强的除草剂草甘膦。
[0003]我国甘氨酸的产能约55万吨，主要通过有机合成法生产。主要包括氯乙酸氨水解法、施特雷克法(Strecker)和海因法(Hydantion)等(徐泽辉，刁春霞，黄亚茹，常慧。甘氨酸的生产现状及发展趋势。2004，石油化工技术经济。20(5):41-45.)。这些方法的原料或制备中间体对环境污染严重，不符合现代社会对工业生产的环保要求。
[0004]利用微生物酶体外催化氨基乙氰酸溶液水解生产甘氨酸，是生物法制备甘氨酸方法之一。20世纪90年代，日本发表了以氨基氰酸为底物，利用微生物酶催化的专利(US5238827)，虽然在30h甘氨酸产量能达到148g/L，但底物氨基乙氰酸毒性大，微生物酶容易受有机物的影响失活。
[0005]尽管利用体外酶催化法能够实现甘氨酸的合成，其仍具有生产局限性。在细胞体内从头法合成甘氨酸能解决这一问题，但是合成途径中参与催化乙醛酸到甘氨酸反应的酶尚无，有待挖掘，也是实现这一技术的关键点。
[0006]综上，目前利用生物法从头合成甘氨酸还处于空白。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种甘氨酸的生产方法。
[0008]第一方面，本专利技术要求保护一种构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法。
[0009]本专利技术所提供的构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法，可包括如下步骤(A1)：
[0010](A1)使受体菌表达乙醛酸氨化酶，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产甘氨酸的工程菌株。
[0011]进一步地，所述乙醛酸氨化酶可为如下a1)-a7)所示7种来源中任一种：
[0012]a1)来源于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的乙醛酸氨化酶；
[0013]a2)来源于少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus globuius)的乙醛酸氨化酶；
[0014]a3)来源于结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的乙醛酸氨化酶；
[0015]a4)来源于海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)的乙醛酸氨化酶；
[0016]a5)来源于玻利维亚盐单胞菌(Halomonas boliviensis)的乙醛酸氨化酶；
[0017]a6)来源于维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)的乙醛酸氨化酶；
[0018]a7)来源于团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia aggregata)的乙醛酸氨化酶。
[0019]进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A2)：
[0020](A2)以所述工程菌1为出发菌株，对其内源的甘氨酸脱羧酶(Glycine decarboxylase)进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够生产甘氨酸的工程菌株。
[0021]进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A3)：
[0022](A3)以所述工程菌2为出发菌株，对其内源的苹果酸合成酶(malate synthase)进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够生产甘氨酸的工程菌株。
[0023]进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A4)：
[0024](A4)以所述工程菌3为出发菌株，对其内源的转录抑制蛋白(transcriptional repressor)进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够生产甘氨酸的工程菌株。
[0025]更进一步地，所述步骤(A1)可为：向所述受体菌中导入所述乙醛酸氨化酶的编码基因，所得菌株即为所述工程菌1。所述步骤(A2)可为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的甘氨酸脱羧酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌2。所述步骤(A3)可为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中苹果酸合成酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌3。所述步骤(A4)可为：以所述工程菌3为出发菌株，敲除基因组中转录抑制蛋白编码基因，所得菌株即为所述工程菌4。
[0026]进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A5)：
[0027](A5)以所述工程菌4为出发菌株，提高内源异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase)的活性和/或表达量，所得菌株命名为工程菌5；所述工程菌5也为能够生产甘氨酸的工程菌株。
[0028]在本专利技术的具体实施方式中，具体是通过将M1-93启动子整合于基因组中异柠檬酸裂解酶编码基因起始密码子前来提高内源异柠檬酸裂解酶的表达量的。
[0029]在步骤(A1)中，所述受体菌可隶属埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌等；也可隶属棒杆菌属(Corynebacterium)，如谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum等；还可隶属单胞菌属(Pseudoalteromonas)，如维氏气单胞菌Aeromonas veronii，或铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa等；亦可隶属芽孢杆菌属(Bacillus)，如海水芽孢杆菌Bacillus aquimaris，或蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，或弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus，或地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis，或贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，或枯草芽孢杆菌Bacillus substilis，或嗜热脂肪芽孢杆菌Geobacillus stearothermophilus，或赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus fusiformis，或少盐芽孢杆菌Paucisalibacillus globuius，或巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium等；还可隶属克雷伯氏菌属(Klebsiella)，如耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis，或结核分支杆菌Mycobacterium tuberculosis；还可隶属酵母属(Saccharomyces)，如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，或解脂耶氏酵母菌Yarrowia lipolytica，或东方伊萨酵母菌Issatchenkia orientalis等。
[0030]在本专利技术的具体实施方式中，所述受体菌具体为大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建能够生产甘氨酸的工程菌株的方法，包括如下步骤(A1)：(A1)使受体菌表达乙醛酸氨化酶，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产甘氨酸的工程菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乙醛酸氨化酶为如下a1)-a7)所示7种来源中任一种的乙醛酸氨化酶：a1)来源于耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶；a2)来源于少盐芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶；a3)来源于结核分支杆菌的乙醛酸氨化酶；a4)来源于海水芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶；a5)来源于玻利维亚盐单胞菌的乙醛酸氨化酶；a6)来源于维氏气单胞菌的乙醛酸氨化酶；a7)来源于团聚拉布伦茨氏菌的乙醛酸氨化酶。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A2)：(A2)以所述工程菌1为出发菌株，对其内源的甘氨酸脱羧酶进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够生产甘氨酸的工程菌株。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A3)：(A3)以所述工程菌2为出发菌株，对其内源的苹果酸合成酶进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够生产甘氨酸的工程菌株。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A4)：(A4)以所述工程菌3为出发菌株，对其内源的转录抑制蛋白进行抑制表达，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够生产甘氨酸的工程菌株。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(A1)为：向所述受体菌中导入所述乙醛酸氨化酶的编码基因，所得菌株即为所述工程菌1；和/或所述步骤(A2)为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的甘氨酸脱羧酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌2；和/或所述步骤(A3)为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中苹果酸合成酶编码基因，所得菌株即为所述工程菌3；和/或所述步骤(A4)为：以所述工程菌3为出发菌株，敲除基因组中转录抑制蛋白编码基因，所得菌株即为所述工程菌4；和/或所述方法还包括如下步骤(A5)：(A5)以所述工程菌4为出发菌株，提高内源异柠檬酸裂解酶的活性和/或表达量，所得菌株命名为工程菌5；所述工程菌5为能够生产甘氨酸的工程菌株。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，所述受菌为大肠杆菌；进一步地，所述受体菌为大肠杆菌ATCC 8739；和/或所述来源于耻垢分枝杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.6所示的蛋白
质，或为SEQ ID No.6经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.6具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.6所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或所述来源于少盐芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的蛋白质，或为SEQ ID No.5经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.5具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.5所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或所述来源于结核分支杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的蛋白质，或为SEQ ID No.7经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.7具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.7所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或所述来源于海水芽孢杆菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质，或为SEQ ID No.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或所述来源于玻利维亚盐单胞菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质，或为SEQ ID No.3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或所述来源于维氏气单胞菌的乙醛酸氨化酶为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质，或为SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，朱欣娜，徐洪涛，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：