重组醋酸菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及微生物领域，具体而言，提供了一种重组醋酸菌及其制备方法和应用。本发明专利技术提供的重组醋酸菌为含有苯丙氨酸解氨酶编码基因的醋酸菌，苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，苯丙氨酸解氨酶编码基因的启动子为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。重组醋酸菌不仅缩短了发酵迟缓期，提高了发酵速率，对于减少能源消耗、提高食醋品质等方面具有重要意义。有重要意义。有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
重组醋酸菌及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及微生物领域，具体而言，涉及一种重组醋酸菌及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]食醋，主要成分为醋酸(乙酸、冰醋酸)，是世界上消费量最大的调味品之一，也是食品、医药、化工、纺织等领域广泛应用的化合物之一。醋酸菌(Acetic acid bacteria，AAB)又名醋酸杆菌，是指能够氧化糖类、醇类生成相应的有机酸的一类革兰氏阴性细菌的总称。目前已知的主要醋酸菌种属包括醋酸杆菌(Acetobacter)、葡糖杆菌(Gluconobacter)以及葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)等，其中，醋酸杆菌属和葡糖杆菌属因其强大的氧化乙醇产生乙酸能力被广泛用于食醋发酵生产。近年来，国内食醋行业发展迅速，但是菌体耐酸性是制约高酸度醋生产的关键因素，如何提高发酵酸度以及改善菌体耐酸性是亟待解决的问题。
[0003]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的在于提供一种重组醋酸菌。
[0005]本专利技术的第二目的在于提供一种重组醋酸菌的制备方法。
[0006]本专利技术的第三目的在于提供一种重组醋酸菌的应用。
[0007]本专利技术的第四目的在于提供一种醋酸发酵方法。
[0008]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0009]一种重组醋酸菌，所述重组醋酸菌为含有苯丙氨酸解氨酶编码基因的醋酸菌；
[0010]苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，苯丙氨酸解氨酶编码基因的启动子为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0011]进一步地，所述醋酸菌将乙醇氧化为醋酸。
[0012]进一步地，所述醋酸菌包括葡糖杆菌、醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，优选为醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，进一步优选为醋化醋杆菌或巴氏醋杆菌，更进一步优选为巴氏醋杆菌CGMCC 3089或巴氏醋杆菌NBRC 3283。
[0013]进一步地，苯丙氨酸解氨酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]进一步地，启动子和苯丙氨酸解氨酶编码基因通过重组载体导入醋酸菌；
[0015]优选地，重组载体的骨架载体包括质粒pBBR1p264(Verena Kallnik,Maria Meyer,Uwe Deppenmeier,et al.Construction of expression vectors for protein production in Gluconobacter oxydans.Journal of Biotechnology 150(2010)460
–
465)。
[0016]上述重组醋酸菌的制备方法，将含有启动子和苯丙氨酸解氨酶编码基因的重组载体导入醋酸菌，得到重组醋酸菌。
[0017]上述重组醋酸菌在醋酸发酵中的应用。
[0018]进一步地，醋酸发酵包括液态表面静置食醋发酵；
[0019]优选地，醋酸发酵的产品包括饮料醋或调味品醋。
[0020]一种醋酸发酵方法，将上述重组醋酸菌作为发酵菌进行发酵生产醋酸。
[0021]进一步地，发酵的原料包括水果、高粱、玉米、小麦或土豆；
[0022]优选地，醋酸发酵的产品包括饮料醋或调味品醋。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0024]本专利技术提供的重组醋酸菌是采用巴氏醋杆菌中醋酸耐受蛋白GroESL的启动子作为粘(深)红酵母(Rhodotorula glutinis)中的苯丙氨酸解氨酶基因pal的启动子，实现苯丙氨酸解氨酶在醋酸菌中表达。该重组醋酸菌中醋酸耐受蛋白GroESL的启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，该启动子可以协同苯丙氨酸解氨酶的表达，大幅度的提高苯丙氨酸解氨酶基因的转录水平，有效增强了能量代谢和氨代谢水平，实现增加菌株胞内铵离子浓度，从而缓解pH变化，提高重组醋酸菌的酸耐受性。同时，重组醋酸菌进行醋酸发酵具有发酵迟缓期短，发酵速率高等优点，从而减少能源消耗、提高生产效率、提高企业效益。此外，苯丙氨酸解氨酶脱氨反应生成的反式肉桂酸，作为一种香料，具有很好的保香作用，可以改善食醋的风味。
[0025]因此，本专利技术提供的重组醋酸菌可以作为醋酸发酵工业中的发酵菌，可以提高产品的酸度同时改善产品的风味。例如生产饮料醋和调味品醋。
[0026]本专利技术提供的重组醋酸菌的制备方法通过采用基因工程的手段将启动子为SEQ ID NO.1的苯丙氨酸解氨酶(SEQ ID NO.3)在醋酸菌中实现表达，在醋酸菌改造的方法中该方法操作简单，重现性好，成本低。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1为实施例1中质粒pBBR1
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Pgro
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pal酶切产物琼脂糖凝胶电泳，其中，M：Marker；1、2：质粒pBBR1
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Pgro
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pal用EcoR V和Cla I双酶切；
[0029]图2为实施例2中原始菌株与重组菌株的醋酸耐受性影响；
[0030]图3为实施例2中原始菌株与重组菌株胞内铵离子含量比较；
[0031]图4为实施例3中液态表面静置发酵食醋发酵过程曲线。
具体实施方式
[0032]下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
[0033]除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。
[0034]本专利技术提供一种重组醋酸菌，为含有苯丙氨酸解氨酶编码基因的醋酸菌，其中，苯
丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，苯丙氨酸解氨酶编码基因的启动子为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0035]专利技术人首次将苯丙氨酸解氨酶引入醋酸菌中，通过调节生物脱氨途径来缓解胞内pH变化从而提高菌体的耐酸性并且提高菌体的发酵效率。其中，启动子来源于巴氏醋杆菌中醋酸耐受蛋白GroES的启动子，该启动子来源于醋酸菌，所以可以最大程度的提高苯丙氨酸解氨酶的表达量同时降低对宿主菌体的刺激反应；苯丙氨酸解氨酶来源于粘(深)红酵母(Rhodotorula glutinis)中的苯丙氨酸解氨酶基因pal，经实验发现该重组醋酸菌可以提高菌株耐酸性，同时提高产酸速率。
[0036]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组醋酸菌，其特征在于，所述重组醋酸菌为含有苯丙氨酸解氨酶编码基因的醋酸菌；苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，苯丙氨酸解氨酶编码基因的启动子为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组醋酸菌，其特征在于，所述醋酸菌将乙醇氧化为醋酸。3.根据权利要求2所述的重组醋酸菌，其特征在于，所述醋酸菌包括葡糖杆菌、醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，优选为醋酸杆菌或葡糖醋杆菌，进一步优选为醋化醋杆菌或巴氏醋杆菌，更进一步优选为巴氏醋杆菌CGMCC3089或巴氏醋杆菌NBRC 3283。4.根据权利要求1所述的重组醋酸菌，其特征在于，苯丙氨酸解氨酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求1
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4任一项所述的重组醋酸菌，其特征在于，启动子和苯丙氨酸解氨酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：周雪峰，何锦荣，
申请(专利权)人：广东天地壹号食品研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：