阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用。本发明专利技术通过基因重组技术在宿主细胞中表达一系列异源的酶，获得了可高效生产阿魏酸类化合物的工程菌。本发明专利技术建立的表达体系代谢背景低、异源表达能力强、成本低，可通过相对简单的步骤合成终产物，为工业化生产阿魏酸、其中间体或其衍生物提供了新的途径。其中间体或其衍生物提供了新的途径。

【技术实现步骤摘要】
阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用


[0001]本专利技术属于合成生物学及工业生物学
；更具体地，本专利技术涉及一种高效合成阿魏酸的重组细胞及其制法和应用。

技术介绍

[0002]植物次生代谢物由于其潜在的优势，几个世纪以来一直受到人们的关注，但其面临生产难度大、成本高的问题。
[0003]阿魏酸是天然存在于植物细胞壁中的抗氧化剂，具有抗炎活性，并且能够充当自由基清除剂，是中药当归、川芎的药效成分，在医药、食品、化妆品等领域都有广泛的应用。现有技术中，从富含阿魏酸的植物原料如当归、阿魏、川芎等中药材和麦麸、米糠中提取阿魏酸是主要的药用或商品阿魏酸的来源，但是存在工业三废处理成本较高的问题。以香兰素和丙二酸为原料通过化学合成方法，得到的产物是顺式阿魏酸和反式阿魏酸的混合物，需要进一步分离得到顺式阿魏酸，分离难度较大。此外，基于生物技术方法，利用一些微生物或酶，利用可再生资源，将阿魏酸前体物质比如丁香酚、木质素、酚类进行转化，得到阿魏酸，高效、清洁，但是工艺尚不成熟，仍需要进一步的研究。
[0004]尽管微生物和微生物基因组序列数据的丰富多样性为开发高效的微生物人工途径提供了一些潜在有用基因资源，但是如何有效地加以选择和利用，仍然是本领域中亟待研究的。
[0005]申请号为201510234157.5的一种阿魏酸生产工程菌株构建方法及生物转化的方法，公开日为2015年9月23日，公开的阿魏酸的生产主要通过以丁香酚为前体，利用强启动子使酶偶联系统包括香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶、和松柏醛脱氢酶基因在大肠杆菌中共表达，同时偶联木糖还原酶，在生产中还原木糖并再生氧化型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，维持阿魏酸生物转化系统的辅酶平衡，经过全细胞催化丁香酚生成阿魏酸。
[0006]综上，本领域还需要进行阿魏酸的生物合成研究，改进生物合成工艺，以解决现有技术中关于阿魏酸生产方面的技术问题，提高阿魏酸的生产效率，降低阿魏酸的生产成本。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用。
[0008]本专利技术的目的还在于提供一种高产阿魏酸的发酵生产方法。
[0009]在本专利技术的第一方面，提供用于生产阿魏酸的重组细胞，其中表达外源的下组酶：酪氨酸解氨酶(TAL)，4-香豆酸-3-羟基化酶(SAM5)和咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)。
[0010]在一个优选例中，所述重组细胞中，不含有外源的下组酶或蛋白：PEPS，DAHPS，CM/PDH，ECH。
[0011]在另一优选例中，所述的重组细胞中还表达外源的以下酶：嘧啶核苷酸转氢酶(pntAB)。
[0012]在另一优选例中，所述酪氨酸解氨酶来自于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，白色链霉菌(Streptomyces albus)，荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinofusca)。
[0013]在另一优选例中，所述4-香豆酸-3-羟基化酶来自于西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)，新月链霉菌(Streptomyces lunaelactis)，法诺卡菌(Nocardia farcinica)，红球菌(Rhodococcus ruber)。
[0014]在另一优选例中，所述咖啡酸-O-甲基转移酶来自于小麦(Triticum aestivum)，大麦(Hordeum vulgare)，高羊茅(Festuca arundinacea)，黑麦草(Lolium perenne)。
[0015]在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶来自于大肠杆菌(Escherichia coli MG1655)。
[0016]在另一优选例中，所述重组细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌或链霉菌，或所述真核细胞包括真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；更佳地，所述重组细胞为大肠杆菌；更佳地，所述大肠杆菌为JM109(DE3)。
[0017]在另一优选例中，所述酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶，咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子，trc启动子；优选地包括T7启动子。
[0018]在另一优选例中，所述复制子包括选自：pBR322，p15a，pSC101；优选地包括pBR322。
[0019]在另一优选例中，所述重组细胞中，不同时包含以p15a作为复制子以及以T5作为启动子的酶表达盒。
[0020]在另一优选例中，所述酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶，咖啡酸-O-甲基转移酶被串联于同一表达盒中，或被分别连接于不同表达盒中；优选地为串联于同一表达盒中。
[0021]在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子；优选地包括T7启动子。
[0022]在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，操纵子包括选自：T7操纵子，T5操纵子。
[0023]在另一优选例中，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，复制子包括：SC101。
[0024]在本专利技术的另一方面，提供所述的重组细胞的用途，用于生产阿魏酸；较佳地，用于将L-酪氨酸转化为阿魏酸。
[0025]在本专利技术的另一方面，提供一种生产阿魏酸的方法，所述方法包括：(1)提供重组细胞，其为前面任一所述的重组细胞；和(2)培养(1)的重组细胞，从而生产阿魏酸。
[0026]在一个优选例中，所述的重组细胞为原核细胞，其以甘油作为碳源进行表达，生产阿魏酸；较佳地，所述细胞的培养基中，甘油按照体积0.5～8％，较佳地1～6％，更佳地1.5～4％，如1.8％，2％，2.5％，3％，3.5％等。
[0027]在另一优选例中，步骤(2)中，所述培养(1)的重组细胞，为在含有L-酪氨酸的培养体系中培养。
[0028]在另一优选例中，所述重组细胞为原核细胞，以选自(但不限于)M9Y培养基、TB培养基、或LB培养基为基础培养基的培养基进行培养。
[0029]在另一优选例中，所述重组细胞的培养温度为25～38℃，如26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、37℃。
[0030]在另一优选例中，所述重组细胞培养时的转速100～400rpm，较佳地150～350rpm，更佳地200～300rpm，如250rpm。
[0031]在另一优选例中，所述重组细胞为原核细胞，优选大肠杆菌，以IPTG诱导表达。
[0032]在另一优选例中，所述重组细胞的发酵时间为1～20天，较佳地2～15天，更佳地2.5～10天(如3、4、5、6、7、8、9天)。
[0033]在另一优选例中，所述L-酪氨酸在培养体系中的浓度为：0.1～50g/L，较佳地0.2～40g/L，更佳地0.4～20g/L。所述培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于生产阿魏酸的重组细胞，其中表达外源的下组酶：酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶和咖啡酸-O-甲基转移酶。2.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，其中还表达外源的以下酶：嘧啶核苷酸转氢酶。3.如权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶来自于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，白色链霉菌(Streptomyces albus)，荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)，棘孢小单孢菌(Micromonospora echinofusca)；所述4-香豆酸-3-羟基化酶来自于西班牙糖丝菌(Saccharothrix espanaensis)，新月链霉菌(Streptomyces lunaelactis)，法诺卡菌(Nocardia farcinica)，红球菌(Rhodococcus ruber)；所述咖啡酸-O-甲基转移酶来自于小麦(Triticum aestivum)，大麦(Hordeum vulgare)，高羊茅(Festuca arundinacea)，黑麦草(Lolium perenne)；和/或所述嘧啶核苷酸转氢酶来自于大肠杆菌(Escherichia coliMG1655)。4.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌或链霉菌，或所述真核细胞包括真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞；更佳地，所述重组细胞为大肠杆菌；更佳地，所述大肠杆菌为JM109(DE3)。5.如权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶，4-香豆酸-3-羟基化酶，咖啡酸-O-甲基转移酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子，trc启动子；优选地包括T7启动子；和/或复制子包括选自：pBR322，p15a，pSC101；优选地包括pBR322。6.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述嘧啶核苷酸转氢酶的表达盒中，启动子包括选自：T7启动子，T5启动子；优选地包括T7启动子；或操纵子包括选自：T7操纵子...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，吕华军，张英，邵洁，刘海利，
申请(专利权)人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：