一种含内参的双标记免疫检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种含内参的双标记免疫检测方法，用于检测样品中目标蛋白，通过将目标蛋白的第二结合蛋白和内参质控采用不同的标记物进行标记，并结合其标记物信号值代入发明专利技术人建立的校正公式进行计算，再将计算结果代入基于标准物建立的拟合曲线中，从而反求出实际样本的目标蛋白浓度。使用该方法可以有效减少免疫检测试剂检测结果受干扰因素影响导致精密度较差的问题，使得检测精密度能提高至CV<5％。同时，基于该方法，发明专利技术人还设计了一种检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，采用其检测可有效降低干扰因素对检测结果的影响，从而提高检测精密度，为提高现有免疫定量分析检测准确性，提供有力保障。提供有力保障。

【技术实现步骤摘要】
一种含内参的双标记免疫检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及体外诊断领域，特别是涉及一种含内参的双标记免疫检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]以抗体为基础的免疫反应是对特定对象检测的最基本、最普遍方法，并且已经广泛地应用到生命科学研究及临床检测领域，但是，目前常规的免疫分析技术中，由于光谱重叠等问题很难实现多组分的同时分析，即使荧光量子点标记的荧光免疫分析也很难实现较多组分同时分析，更为重要的是，这些常规的免疫分析方法最终都要经过一个反应过程，如显色反应或发光反应，才能够被检测器检测到，而这种反应的稳定性、一致性等都会直接影响定量结果的准确性，因此，发展一种精准的免疫定量分析，提高临床检测结果的可靠性就显得尤为重要。
[0003]目前的液相免疫检测试剂一般使用一个发光物作为示踪物，常用的发光物有碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素、镧系金属元素等，采用两种不同的发光物同时制备一个试剂盒可以检测样本中两种不同的物质，称之为双标记免疫检测试剂。但是受限于其他干扰因素的影响，包括光源稳定性，室内温度，仪器温度，取样精度，试剂精度等，试剂盒总精密度通常只能做到10％。

技术实现思路

[0004]基于此，本专利技术的目的之一在于提出一种提高检测精确度的、含内参的用于样品中目标蛋白的检测方法。
[0005]包括如下技术方案：
[0006]一种用于样品中目标蛋白的检测方法，其包括如下步骤：
[0007]提供载体，所述载体上包被有第一结合蛋白和内参蛋白；
[0008]加入待测样本和双标记免疫检测试剂，其中，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，所述发光物1与发光物2属于两种不同的发光物，所述第二结合蛋白能够与目标蛋白特异性结合，所述第一结合蛋白能够与目标蛋白和/或发光物1标记的第二结合蛋白结合，所述内参蛋白与发光物2标记的内参质控蛋白特异性结合；
[0009]孵育反应后，洗涤去除未结合的双标记免疫检测试剂；
[0010]检测得到发光物1的荧光信号值T
’
和发光物2的荧光信号值C
’
，将其按照T
’
rel
＝(T
’‑
B1)/(C
’‑
B2)，进行运算得到T
’
rel
，将T
’
rel
代入拟合标准曲线函数中得到对应浓度值，得到校准后的待测样本中分析物的浓度值；其中，B1、B2分别为发光物1与发光物2的背景信号检测值。
[0011]在其中一些实施例中，上述载体为固相载体，进一步地包括包被板、微孔滤膜以及含铁的磁性微粒。
[0012]在其中一些实施例中，上述特异性结合是指有指向的、能被相应物质竞争阻断的某种配基在体外或体内与特异结构位点相互作用的生物结合过程。如抗原和抗体或受体和配体之间的结合，效应T细胞和靶细胞结合；有特异性的(抗体等)和相应的病毒或细胞结合。
[0013]在其中一些实施例中，上述拟合标准曲线函数的制备包括如下步骤：
[0014](1)检测双标记免疫检测试剂中两种发光物的背景信号值，分别为B1、B2；
[0015](2)准备n个不同浓度的目标蛋白标准品样本，将每个样本分别采用步骤(1)中的所述双标记免疫检测试剂进行检测，得到n个发光物1的荧光信号值T和n个发光物2的荧光信号值C；
[0016](3)将步骤(2)中得到的荧光信号值T和荧光信号值C按照公式：T
rel
＝(T
‑
B1)/(C
‑
B2)，计算得到n个新数据T
rel
；
[0017](4)曲线拟合：将步骤(3)得到的T
rel
值作为纵坐标，将目标蛋白标准品的浓度值作为横坐标，进行四参数回归得到对应的拟合曲线函数，作为试剂盒的校准曲线。
[0018]在其中一些实施例中，上述双标记免疫检测试剂中的发光物1和发光物2为分别独立选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素和镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。
[0019]在其中一些实施例中，上述发光物1和发光物2不同，所述发光物1选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种，所述发光物2选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种；或，所述发光物1选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种，所述发光物2选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种。
[0020]在其中一些实施例中，上述发光物1和发光物2为分别独立选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。
[0021]在其中一些实施例中，上述内参质控蛋白选自鸡IgY、羊抗鸡IgY、生物素、亲和素、兔IgG、羊抗兔IgG中的任意一种。
[0022]在其中一些实施例中，上述方法中，所述发光物1标记的第二结合蛋白的稀释比例为1:200～1:10000；所述发光物2标记内参质控的稀释比例为1:200～1:20000。
[0023]在其中一些实施例中，上述方法中，所述发光物1标记的第二结合蛋白的稀释比例为1:200～1:10000；所述发光物2标记内参质控的稀释比例为1:1000～1:10000。
[0024]在其中一些实施例中，上述中，所述发光物1标记的第二结合蛋白浓度为1.0
×
10
‑3mg/mL～2.0
×
10
‑5mg/mL；发光物2标记内参质控浓度为2.0
×
10
‑4mg/mL～2.0
×
10
‑5mg/mL。
[0025]在其中一些实施例中，上述拟合标准曲线函数制备的步骤(2)中，所述不同浓度目标蛋白标准品样本数量n为5～8的整数，不同浓度间相差1
‑
20倍。
[0026]在其中一些实施例中，上述检测方法为夹心免疫测定法或竞争性免疫测定法。
[0027]在其中一些实施例中，上述检测方法包括但不限于双抗体夹心法，双抗原夹心法，间接法，竞争法，中和抑制法。其中双抗体夹心法：使用特异性抗体与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入含发光物1标记的特异性抗体与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标抗原的浓度呈正比，发光物2的信号值理论上为固定值；双抗原夹心法：使用特异性抗原与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入
含发光物1标记的特异性抗原与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检测，含发光物1的信号与样本目标抗体的浓度呈正比，发光物2的信号值理论上为固定值；间接法：使用特异性抗原与内参包被物包被固相载体，加入样本后，再加入含发光物1标记的二抗与发光2标记的内参质控抗体，孵育洗涤后检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于样品中目标蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提供载体，所述载体上包被有第一结合蛋白和内参蛋白；加入待测样本和双标记免疫检测试剂，其中，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，所述发光物1与发光物2属于两种不同的发光物，所述第二结合蛋白能够与目标蛋白特异性结合，所述第一结合蛋白与目标蛋白和/或发光物1标记的第二结合蛋白特异性结合，所述内参蛋白与发光物2标记的内参质控蛋白特异性结合；孵育反应后，洗涤去除未结合的双标记免疫检测试剂；检测得到发光物1的荧光信号值T
’
和发光物2的荧光信号值C
’
，将其按照T
’
rel
＝(T
’‑
B1)/(C
’‑
B2)，进行运算得到T
’
rel
，将T
’
rel
代入拟合标准曲线函数中得到对应浓度值，得到校准后的待测样本中分析物的浓度值；其中，B1、B2分别为发光物1与发光物2的背景信号检测值。2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述拟合标准曲线函数的制备包括如下步骤：(1)检测双标记免疫检测试剂中两种发光物的背景信号值，分别为B1、B2；(2)准备n个不同浓度的目标蛋白标准品样本，将每个样本分别采用步骤(1)中的所述双标记免疫检测试剂进行检测，得到n个发光物1的荧光信号值T和n个发光物2的荧光信号值C；(3)将步骤(2)中得到的荧光信号值T和荧光信号值C按照公式：T
rel
＝(T
‑
B1)/(C
‑
B2)，计算得到n个新数据T
rel
；(4)曲线拟合：将步骤(3)得到的T
rel
值作为纵坐标，将目标蛋白标准品的浓度值作为横坐标，进行四参数回归得到对应的拟合曲线函数，作为试剂盒的校准曲线。3.根据权利要求1
‑
2任一项所述检测方法，其特征在于，所述双标记免疫检测试剂中的发光物1和发光物2为分别独立选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素和镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述发光物1和发光物2不同，所述发光物1选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种，所述发光物2选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种；或，所述发光物1选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种，所述发光物2选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种。5.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述发光物1和发光物2为分别独立选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。6.根据权利要求1
‑
2任一项所述检测方法，其特征在于，所述内参质控蛋白选自鸡IgY、羊抗鸡IgY、生物素、亲和素、兔IgG、羊抗兔IgG中的任意一种。7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述发光物1标记的第二结合蛋白浓度为1.0
×
10
‑3...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一一页附图六页，
申请(专利权)人：广州万孚生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：