基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法技术

本发明专利技术涉及一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，包括将抗原稀释至预设浓度后分组静置，洗涤后备用；将HRP标记蛋白分组并分别稀释至不同浓度；将HRP标记蛋白滴入至抗原内，孵育后加入底物夜，依次检测各组标定混合物的亮度，根据HRP标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线以确定HRP抗体的工作浓度。本发明专利技术通过实时监测各组HRP标记蛋白与抗原之间的反应情况从而精准确定各组标定混合物在反应过程中释放的实际亮度值并得到精准的浓度

【技术实现步骤摘要】
基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法


[0001]本专利技术涉及标记蛋白工作浓度检测
，尤其涉及一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法。

技术介绍

[0002]辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，其名称的由来是因为在辣根中该酶的含量很高，它是目前使用最广泛的一种标记酶，用来标记抗体或其它蛋白质，既能用于定位检测，也能于定量测定。辣根过氧化物酶结构稳定且催化性能特殊，可以在宽泛的条件下对氧化吩类及苯胺类芳香族化合物的氧化反应均有良好的催化功能。而且它的反应温和、活性高、选择性高且无污染，常用于医学诊断生化检测等各个领域。而石墨烯量子点是一种准零维的纳米材料，尺寸可以在几个纳米以下，具有一层、两层或者几层的石墨烯结构，石墨烯量子点表现出生物低毒性、优异的水溶性、化学惰性、稳定的光致发光、良好的表面修饰，在生物、化学、药理等领域有着广泛的应用，本文建立利用石墨烯量子点作为荧光探针构建辣根过氧化物酶检测的新方法。
[0003]在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
[0004]然而，在现有技术中，无法针对用作标记蛋白的HRP的工作浓度进行快速精准的测量，从而导致在使用HRP标记蛋白进行标记时易出现偏差，无法对标记物进行精准测量，导致HRP标记蛋白针对标记物的测量精度低。

技术实现思路

[0005]为此，本专利技术提供一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，用以克服现有技术中无法针对HRP标记蛋白的工作浓度进行精准检测的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，包括：步骤a，使用包被缓冲液将抗原稀释至预设浓度后将稀释后抗原分成多组，将各组抗原分别物理吸附于不同的固相载体并在预设静置温度环境下将各组抗原静置预设时长；步骤b，使用洗涤缓冲液依次洗涤所述步骤a中静置预设时长的多组抗原并在洗涤完成后备用；步骤c，将HRP标记蛋白分成多组，使用BSA
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PBS溶液依次对各组HRP标记蛋白进行稀释以制备多组不同浓度的HRP标记蛋白；步骤d，依次将所述步骤c中制备的不同浓度的HRP标记蛋白滴入至对应组的所述抗原内以形成标定混合物，将固相载体加热至预设孵育温度以对标定混合物进行孵育并在标定混合物的孵育时长达到预设值时向各组标定混合物所在固相载体内加入底物夜，加入完成后实时监测各组固相载体中标定混合物的反应情况，当判定标定混合物反应完成时，
使用比色仪依次检测不同组标定混合物的亮度值，根据标定混合物中的HRP标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线图并根据曲线图确定HRP抗体的工作浓度；在针对第i组所述标定混合物的反映情况进行监测时，设定i=1，2，3，...n，建立预设反映情况矩阵Qi，设定Qi（Si，fi，Ni，tmaxi），其中，Si为第i组标记蛋白的稀释浓度，fi为针对第i组标定混合物亮度的检测周期，Ni为针对第i组标定混合物亮度的预设判定周期数量，tmaxi为针对第i组标定混合物的最大监测时长；当针对所述第i组标定混合物的反映情况进行监测时，记录反应总时长并使用比色仪周期性检测该组标定混合物的亮度Li，当反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度Li1并在检测完成时重新记录反应时长，当重新记录的反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度Li2，重复上述过程以依次检测各周期内标定混合物的亮度；在记录过程中，设定比色仪在第j个监测周期测得的标定混合物亮度为Lij，若比色仪在第j+1个监测周期测得的标定混合物亮度值Lij+1＜Lij，则判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为Lij，若比色仪在第j+1个监测周期测得的标定混合物亮度值Lij+1=Lij，则将判定周期数量N记为2，当比色仪在检测过程中测得该组标定混合物的亮度值为Lij的检测周期数量N=Ni时，判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为Lij；在检测过程中，当监测总时长达到tmaxi时，判定该组标定混合物反应完成并从测得的多个亮度值中选取最大值作为该组标定混合物的亮度值。
[0007]进一步地，当完成对所述各组含有不同浓度HRP标记蛋白的标定混合物的亮度的判定时，以亮度值为纵坐标，HRP标记蛋白浓度为横坐标，根据针对上述标定混合物的检测结果绘制曲线并计算曲线中各点的斜率，将曲线斜率最大值所处点位代表的HRP标记蛋白浓度确定为HRP标记蛋白的工作浓度。
[0008]进一步地，在所述步骤a中，建立预设抗原浓度矩阵R0和预设组数矩阵n0，对于所述预设抗原浓度矩阵R0，设定R0（R1，R2，R3），其中，R1为第一预设抗原浓度，R2为第二预设抗原浓度，R3为第三预设抗原浓度，R1＜R2＜R3，对于所述预设组数矩阵n0，设定n0（n1，n2，n3），其中，n1为第一预设组数，n2为第二预设组数，n3为第三预设组数，n3＞n2＞n1；当使用包被缓冲液完成对抗原的稀释时，检测稀释后抗原的浓度R，若R≤R1，则将稀释后抗原分为n1组，若R1＜R≤R2，则将稀释后的抗原分为n2组，若R2＜R≤R3，则将稀释后的抗原分为n3组。
[0009]进一步地，当完成对所述抗原的分组时，建立HRP标记蛋白稀释参数矩阵H，设定H（s，D），其中，s为HRP标记蛋白初始稀释浓度，D为HRP标记蛋白浓度稀释梯度，在针对所述各组HRP标记蛋白的浓度的确定时，根据所述抗原的浓度R确定HRP标记蛋白的初始浓度并根据抗原的组数n确定各相邻组HRP标记蛋白之间的浓度梯度。
[0010]进一步地，在所述HRP标记蛋白稀释参数矩阵H（s，D）中嵌套HRP标记蛋白预设初始浓度矩阵s0，设定s0（s1，s2，s3），其中，s1为HRP标记蛋白第一预设初始浓度，s2为HRP标记蛋白第二预设初始浓度，s3为HRP标记蛋白第三预设初始浓度，s1＜s2＜s3，在判定HRP标记蛋白初始浓度时，若抗原的浓度R≤R1，则将HRP标记蛋白的初始浓度设为s1，若R1＜R≤R2，则将HRP标记蛋白的初始浓度设为s2，若R2＜R≤R3，则将HRP标记蛋白的初始浓度设为s3。
[0011]进一步地，在所述HRP标记蛋白稀释参数矩阵H（s，D）中嵌套HRP标记蛋白预设浓度梯度矩阵D0，设定D0（D1，D2，D3），其中，D1为HRP标记蛋白第一预设浓度梯度，D2为HRP标记
蛋白第二预设浓度梯度，D3为HRP标记蛋白第三预设浓度梯度，D1＜D2＜D3，在判定各组HRP标记蛋白间的浓度梯度时，若所述抗原的组数为nk，设定k=1，2，3，则将各组HRP标记蛋白间的浓度梯度设置为Dk。
[0012]进一步地，当判定HRP标记蛋白的初始浓度设为sx并将各组HRP标记蛋白间的浓度梯度设置为Dk时，设定x=1，2，3，则对于所述第i组HRP标记蛋白的浓度Si，设定Si=sx+i
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，其特征在于，包括：步骤a，使用包被缓冲液将抗原稀释至预设浓度后将稀释后抗原分成多组，将各组抗原分别物理吸附于不同的固相载体并在预设静置温度环境下将各组抗原静置预设时长；步骤b，使用洗涤缓冲液依次洗涤所述步骤a中静置预设时长的多组抗原并在洗涤完成后备用；步骤c，将HRP标记蛋白分成多组，使用BSA
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PBS溶液依次对各组HRP标记蛋白进行稀释以制备多组不同浓度的HRP标记蛋白；步骤d，依次将所述步骤c中制备的不同浓度的HRP标记蛋白滴入至对应组的所述抗原内以形成标定混合物，将固相载体加热至预设孵育温度以对标定混合物进行孵育并在标定混合物的孵育时长达到预设值时向各组标定混合物所在固相载体内加入底物夜，加入完成后实时监测各组固相载体中标定混合物的反应情况，当判定标定混合物反应完成时，使用比色仪依次检测不同组标定混合物的亮度值，根据标定混合物中的HRP标记蛋白浓度和亮度值绘制曲线图并根据曲线图确定HRP抗体的工作浓度；在针对第i组所述标定混合物的反映情况进行监测时，设定i=1，2，3，...n，建立预设反映情况矩阵Qi，设定Qi（Si，fi，Ni，tmaxi），其中，Si为第i组标记蛋白的稀释浓度，fi为针对第i组标定混合物亮度的检测周期，Ni为针对第i组标定混合物亮度的预设判定周期数量，tmaxi为针对第i组标定混合物的最大监测时长；当针对所述第i组标定混合物的反映情况进行监测时，记录反应总时长并使用比色仪周期性检测该组标定混合物的亮度Li，当反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度Li1并在检测完成时重新记录反应时长，当重新记录的反应时长达到fi时，使用比色仪检测检测标定混合物的亮度Li2，重复上述过程以依次检测各周期内标定混合物的亮度；在记录过程中，设定比色仪在第j个监测周期测得的标定混合物亮度为Lij，若比色仪在第j+1个监测周期测得的标定混合物亮度值Lij+1＜Lij，则判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为Lij，若比色仪在第j+1个监测周期测得的标定混合物亮度值Lij+1=Lij，则将判定周期数量N记为2，当比色仪在检测过程中测得该组标定混合物的亮度值为Lij的检测周期数量N=Ni时，判定该组标定混合物反应完成并将该组标定混合物的反应亮度记为Lij；在检测过程中，当监测总时长达到tmaxi时，判定该组标定混合物反应完成并从测得的多个亮度值中选取最大值作为该组标定混合物的亮度值。2.根据权利要求1所述的基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，其特征在于，当完成对所述各组含有不同浓度HRP标记蛋白的标定混合物的亮度的判定时，以亮度值为纵坐标，HRP标记蛋白浓度为横坐标，根据针对上述标定混合物的检测结果绘制曲线并计算曲线中各点的斜率，将曲线斜率最大值所处点位代表的HRP标记蛋白浓度确定为HRP标记蛋白的工作浓度。3.根据权利要求1所述的基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，其特征在于，在所述步骤a中，建立预设抗原浓度矩阵R0和预设组数矩阵n0，对于所述预设抗原浓度矩阵R0，设定R0（R1，R2，R3），其中，R1为第一预设抗原浓度，R2为第二预设抗原浓度，R3为第三预设抗原浓度，R1＜R2＜R3，对于所述预设组数矩阵n0，设定n0（n1，n2，n3），其中，n1为第一预设组数，n2为第二预设组数，n3为第三预设组数，n3＞n2＞n1；当使用包被缓冲液完成对抗原的稀释时，检测稀释后抗原的浓度R，若R≤R1，则将稀释
后抗原分为n1组，若R1＜R≤R2，则将稀释后的抗原分为n2组，若R2＜R≤R3，则将稀释后的抗原分为n3组。4.根据权利要求3所述的基于HRP标记蛋白的工作浓度检测方法，其特征在于，当完成对所述抗原的分组时，建立HRP标记蛋白稀释参数矩阵H，设定H（s，D），其中，s为HRP标记蛋白初始稀释浓度，D为H...

【专利技术属性】
技术研发人员：方卫斌，
申请(专利权)人：天德瑞北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：