一种制备高纯度的成熟人树突状细胞的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种制备高纯度、成熟人树突状细胞的方法及应用，具体地，本发明专利技术通过单核细胞诱导分化为高纯度的非成熟树突状细胞、非成熟树突状细胞摄取加工抗原、非成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞几个环节，使得制备的树突状细胞具有高纯度、高得率，可有效摄取加工抗原，诱导活化抗原特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。诱导活化抗原特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。诱导活化抗原特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种制备高纯度的成熟人树突状细胞的方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物技术和细胞治疗领域，具体地，本专利技术涉及一种高纯度的成熟人树突状细胞的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]树突状细胞(Dendritic cells，DC)是1973年由美国Steinman首先发现的，因其成熟时伸出许多树突状或伪足样突起而得名。DC是目前所知抗原提呈功能最强的APC，最大的特点是能够刺激初始T细胞(na
ï
ve T cell)活化和增殖，而Mφ、B细胞等仅能刺激已活化的T细胞或记忆T细胞，因此，DC是特异性免疫应答的始动者，在免疫系统中占有独特地位。
[0003]DC可由骨髓中髓样干细胞和淋巴样干细胞分化而来，分别称为髓系DC(myeloid DC,MDC)、淋巴系DC(lymphoid DC，LDC)，大多数DC来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身组织。DC广泛分布于脑以外的全身各器官，数量少，仅占外周血单个核细胞的1%以下，占小鼠脾细胞的0.2%
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0.5%。根据DC的成熟状态，可将DC分为DC前体、未成熟DC、迁移期DC和成熟DC。DC前体细胞经血循环或淋巴循环进入多种实体器官及非淋巴组织的上皮部位，在某些细胞因子作用下分化、发育为未成熟DC(immature DC, iDC)。正常情况下，体内绝大多数DC处于未成熟状态，它们仅表达低水平的MHCⅡ类分子、共刺激分子和粘附分子，在体外激发MLR能力较弱；但表达较多的FcR和病原体受体，具有极强的摄取和加工处理抗原的能力。iDC在摄取抗原或受到某些刺激(主要是炎性信号如LPS、IL1β、TNFα)后，未成熟DC即开始分化成熟。成熟的DC(mature DC，mDC)表达大量MHCⅡ类分子和共刺激分子(CD80、CD40、CD86等)，能有效地将加工、处理后的抗原以抗原肽
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MHCⅡ类分子复合物的形式提呈给初始T细胞，并使之激活。
[0004]全球范围的DC肿瘤疫苗研究持续了近20年，目前，全球已经有4种DC肿瘤疫苗已经获得上市批准：Hybricell(Genoa Biotecnologia,巴西)、CreaVaX RCC(CreaGene,韩国)、Sipuleucel
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T(Dendreon,美国)、APCEDEN(APAC Biotech,印度)。截止2020年4月，在美国国立卫生研究院管理的“Clinical trail”临床数据登记平台显示，以“Dendritic cells”为关键词共有1024项DC细胞治疗临床试验登记，包括62项临床
Ⅲ‑Ⅳ
产品试验登记。美国、中国、欧盟是开发DC细胞治疗的主要国家和地区，在美国开展的临床试验有503项，中国为103项，中国已经成为仅次于美国的DC研发热地。在适应症方面，DC细胞治疗的主要适应症为黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、脑癌、前列腺癌、白血病和HIV感染等，在肿瘤治疗领域，全球处于临床Ⅲ期的正在进行DC产品有13个。
[0005]获得高纯度、成熟的、可活化抗原特异性T淋巴细胞的DC是临床研究的关键。常规的制备DC的方法存在纯度低、成熟度不够的情况，容易导致细胞功能缺失，批间差异太大的问题，导致临床应用中效果不佳或出现免疫耐受情况。
[0006]因此，有必要对DC的培养方法进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在临床应用中的疗效。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种新的制备高纯度、成熟人树突状细胞的方法；本专利技术制备的人树突状细胞，纯度达到80%，得率达到8%，CD83和CCR7的阳性细胞比例达到80%以上，可有效诱导抗原特异性的CTL，分泌IFN
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γ和穿孔素，杀伤肿瘤细胞。
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种诱导单核细胞分化为树突状细胞(DC)的方法，包括步骤：(a) 提供一经终浓度为1
‑
10ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被的培养瓶；(b) 在所述经包被的培养瓶中，在含100ng/ml
‑
400ng/ml的rhGM
‑
CSF的第一基础培养基的培养体系中，培养单个核细胞1
‑
4小时，从而使得单个核细胞中的单核细胞贴壁于所述培养瓶；(c) 将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养瓶贴壁的单核细胞进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁单核细胞；和(d) 在添加了血清替代品或AB型血清、rhGM
‑
CSF、和rhIL
‑
4的第二基础培养基中，并在培养条件下，对上一步骤获得的经分离的贴壁单核细胞进行培养3
‑
5天后，从而获得纯度大于80%的非成熟树突状细胞。
[0009]在另一优选例中，在步骤(a)中，将用于培养单个核细胞的培养瓶预先经终浓度为1
‑
10ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被处理，从而获得经包被的培养瓶。
[0010]在另一优选例中，在步骤(b)中，将分离的PBMC作为单个核细胞接种于所述的培养体系。
[0011]在另一优选例中，在步骤(b)中，将单个核细胞以4
×
106‑
10
×
106/ml接种于所述含100ng/ml
‑
400ng/mlrhGM
‑
CSF的第一基础培养基。
[0012]在另一优选例中，在步骤(c)中，用第一基础培养基进行洗涤，洗涤次数为1
‑
4次。
[0013]在另一优选例中，所述的步骤(d)中，AB型血清浓度为2
‑
10体积%，rhGM
‑
CSF浓度为100ng/ml
‑
400ng/ml，rhIL
‑
4浓度为100ng/ml
‑
1000ng/ml。
[0014]在另一优选例中，所述的步骤(d)中，还包括对培养体系的培养基进行换液处理，并且对换下的培养基中悬浮的树突状细胞进行离心收集后，用新鲜的第二培养基重悬后传回原培养瓶中继续培养。
[0015]在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：(e)用感兴趣的抗原对所述非成熟树突状细胞进行致敏处理，从而获得经所述抗原致敏的非成熟树突状细胞。
[0016]在另一优选例中，所述的感兴趣的抗原包括肿瘤相关抗原、病毒抗原、或其组合。
[0017]在另一优选例中，所述的肿瘤相关抗原包括肿瘤特异性抗原。
[0018]在另一优选例中，所述的病毒抗原包括：HIV病毒抗原、HPV病毒抗原、或其组合。
[0019]在另一优选例中，将在步骤(d)后获得的非成熟树突状细胞与感兴趣的抗原共孵育4
‑
36小时（较佳地12
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24小时），从而获得经抗原致敏的非成熟树突状细胞。
[0020]在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：(f)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导单核细胞分化为树突状细胞的方法，其特征在于，包括步骤：(a) 提供一经终浓度为1
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10ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被的培养瓶；(b) 在所述经包被的培养瓶中，在含100ng/ml
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400ng/ml的rhGM
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CSF的第一基础培养基的培养体系中，培养单个核细胞1
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4小时，从而使得单个核细胞中的单核细胞贴壁于所述培养瓶；(c) 将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养瓶贴壁的单核细胞进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁单核细胞；(d) 在添加了血清替代品或AB型血清、rhGM
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CSF、和rhIL
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4的第二基础培养基中，并在合适的培养条件下，对上一步骤获得的经分离的贴壁单核细胞进行培养3
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5天后，从而获得纯度大于80%的非成熟树突状细胞；(e)用感兴趣的抗原对所述非成熟树突状细胞进行致敏处理，从而获得经所述抗原致敏的非成熟树突状细胞；和(f)将步骤(e)获得的经抗原致敏的非成熟树突状细胞，在添加了5
‑
15μg/ml PGE2，500
‑
1500IU/ml TNFα，和1
‑
10μg/ml CD40L的第三基础培养基中，并在合适的培养条件下，培养16
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60小时后，从而获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：吁亭，蒋应明，陈国友，
申请(专利权)人：上海惠盾因泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：