热休克蛋白gp96-多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法技术

本发明专利技术公开了热休克蛋白gp96

【技术实现步骤摘要】
热休克蛋白gp96
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多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体是热休克蛋白gp96
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多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法。

技术介绍

[0002]树突状细胞(dendritic cell，DC)由Steinman和Cohn于1973年发现，因其表面具有星状多形性或树枝状突起而得名。DC具有其他细胞所没有的形态特点和运动能力，分布十分广泛，DC不但具有吞噬能力，而且是迄今已知的功能最强的抗原提呈细胞，可以有效地刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞活化，从而将固有免疫和获得性免疫有机地联系起来，在肿瘤等疾病治疗中发挥重要作用。
[0003]胎盘来源多肽中包含大量热休克蛋白，热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，加热、缺氧、病毒感染、重金属中毒、氧化剂等刺激因素都可诱导其表达增加。HSP根据同源程度及分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP及泛素等多个亚家族。Gp96(GRP94)为内质网HSP90家族的代表，与细胞质HSP90高度同源，作为分子伴侣，参与蛋白折叠、蛋白降解、蛋白复合体组装、转运、抗原处理、蛋白定位等生物学过程。随着近年来对Gp96的深入研究发现，Gp96能够与抗原肽结合形成Gp96
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多肽复合物，在肿瘤的免疫治疗中起重要作用。在免疫反应过程中，Gp96能够将结合到的抗原肽交叉呈递给MHC I类分子，引起CTL反应，同时Gp96还能诱导DC细胞成熟，释放细胞因子等物质，激活抗肿瘤免疫应答过程。
[0004]目前，现有技术中，利用生物技术活化DC细胞主要通过体内生物途径，效率不高，效果不明显。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供一种热休克蛋白gp96
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多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法，能够提高DC细胞体外活化效率，增强DC细胞摄取抗原能力，提高激活特异性T细胞效率。
[0006]本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
[0007]热休克蛋白gp96
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多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法，包括步骤：
[0008]S1、配置DC细胞诱导培养基；
[0009]S2、培养第0天，将制备好的PBMC细胞，用RPMI1640培养液重悬，并铺于培养瓶中，静置于CO2培养箱中孵育2h；
[0010]S3、孵育结束，轻晃培养瓶，去除悬浮细胞液，并洗涤，然后于培养瓶中加入预先配置好的DC细胞诱导培养基，继续放置于CO2培养箱培养；
[0011]S4、培养第2天，培养瓶加入DC
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III、DC
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IV以及DC
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V，继续放置于CO2培养箱培养；
[0012]S5、培养第3天,收集DC细胞于离心管中，进行离心处理，弃上清后混合转移至EP管中，加DC细胞培养基重悬；
[0013]S6、取热休克蛋白gp96
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多肽复合物试剂加入步骤S5的EP管中，于CO2培养箱中孵育4h；
[0014]S7、孵育结束后，进行洗涤，备用。
[0015]优选的，步骤S1中，所述DC细胞诱导培养基包括45mLDC培养基、5mLDC培养基添加剂、15μL的DC
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I、5μL的DC
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II。
[0016]优选的，所述步骤S2、S3、S4、S6中的CO2培养箱的温度为37℃、CO2水平为5％。
[0017]优选的，步骤S3中，在洗涤时，采用移液管吸取RPMI1640或PBS缓冲液轻轻冲洗贴有细胞的培养瓶壁。
[0018]优选的，步骤S3中，在洗涤时，用RPMI1640培养液或生理盐水洗涤两次。
[0019]优选的，步骤S5中，离心时采用600g离心5min。
[0020]优选的，所述培养瓶采用T75培养瓶。
[0021]优选的，步骤S7中，用0.9％生理盐水洗涤2次。
[0022]对比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0023]1、通过体外活化DC细胞，能够提高活化效率，增强DC细胞摄取抗原能力；
[0024]2、通过胎盘来源多肽(热休克蛋白gp96)活化DC，能够增强DC细胞抗原提呈能力进而提高激活特异性T细胞效率；
[0025]3、采用体外活化DC细胞可快速扩增繁殖，更短时间获得更多DC细胞并增强细胞活性。
附图说明
[0026]附图1是实施例中台盼蓝染色检测细胞活力图一；
[0027]附图2是实施例中台盼蓝染色检测细胞活力图二；
[0028]附图3是实施例中台盼蓝染色检测细胞活力图三；
[0029]附图4是实施例中流式细胞仪检测DC细胞表面FSC
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H的示意图；
[0030]附图5是实施例中流式细胞仪检测DC细胞表面CD11 FITC
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H的示意图；
[0031]附图6是实施例中流式细胞仪检测DC细胞表面CD80的示意图；
[0032]附图7是实施例中流式细胞仪检测DC细胞表面CD83的示意图；
[0033]附图8是实施例中流式细胞仪检测DC细胞表面CD86的示意图；
[0034]附图9是实施例中流式细胞仪检测DC细胞表面HLDR的示意图。
具体实施方式
[0035]下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
[0036]实施例：如附图1
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9所示，本专利技术所述是热休克蛋白gp96
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多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法，包括步骤：
[0037]S1、配置DC细胞诱导培养基50mL(含45mLDC培养基、5mLDC培养基添加剂、15μL的DC
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I与5μL的DC
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II)；
[0038]注意：
[0039]①
、DC培养基添加剂，提前从
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20℃冰箱放置冷藏慢慢解冻；
[0040]②
、DC培养基添加剂完全溶解后，轻轻摇晃瓶身，使其温度与成分均一，摇晃时，小心避免气泡产生；解冻时，若有蛋白沉淀，通过离心或使用0.22um滤器去除。
[0041]S2、培养第0天，将制备好1*108PBMC细胞，用50mL的RPMI1640培养液重悬，并铺于1个T75培养瓶中(即培养瓶铺有50mL的PBMC悬液)，静置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育2h；
[0042]S3、孵育结束，轻晃T75培养瓶，去除悬浮细胞液，用20mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.热休克蛋白gp96
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多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法，其特征在于，包括步骤：S1、配置DC细胞诱导培养基；S2、培养第0天，将制备好的PBMC细胞，用RPMI1640培养液重悬，并铺于培养瓶中，静置于CO2培养箱中孵育2h；S3、孵育结束，轻晃培养瓶，去除悬浮细胞液，并洗涤，然后于培养瓶中加入预先配置好的DC细胞诱导培养基，继续放置于CO2培养箱培养；S4、培养第2天，培养瓶加入DC
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III、DC
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IV以及DC
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V，继续放置于CO2培养箱培养；S5、培养第3天,收集DC细胞于离心管中，进行离心处理，弃上清后混合转移至EP管中，加DC细胞培养基重悬；S6、取热休克蛋白gp96
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多肽复合物试剂加入步骤S5的EP管中，于CO2培养箱中孵育4h；S7、孵育结束后，进行洗涤，备用。2.根据权利要求1所述的热休克蛋白gp96
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多肽复合物体外活化DC细胞的共培养方法，其特征在于：步骤S1中，所述DC细胞诱导培养基包括45mLDC培养基、5mLDC培养基添加剂、15μL的DC
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I、5μL的DC
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【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，范志青，郑清富，
申请(专利权)人：和泓尚医成都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：