一种Gp96-多肽复合物（CTL-OT）的提取纯化方法技术

本发明专利技术涉及热休克蛋白制备技术领域，具体涉及一种Gp96‑多肽复合物的提取纯化方法，包括如下步骤：将人源的离体胎盘组织或肿瘤组织研磨制成匀浆液，然后将该匀浆液离心提取煽情也，将该上清液依次经过Gp96单克隆抗体‑Sepharose 4B亲和层析、HiTrap‑Q Sepharose离子交换层析提取、纯化，即得。本发明专利技术以人源的离体胎盘或肿瘤组织作为原料，通过Gp96单克隆抗体‑Sepharose 4B亲和层析和HiTrap‑Q Sepharose离子交换层析得到Gp96‑多肽复合物，显著提高了Gp96‑多肽复合物的提取纯化获得含量和效率。

【技术实现步骤摘要】
一种Gp96-多肽复合物(CTL-OT)的提取纯化方法
本专利技术涉及热休克蛋白制备
，具体涉及一种Gp96-多肽复合物(CTL-OT)的提取纯化方法。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。癌症是一类严重危害群众健康的慢性病，我国每年新发癌症病例超过350万，死亡病例超过200万，因此对癌症的防控形势十分严峻。我国最常见的癌症包括肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、食管癌、子宫颈癌、甲状腺癌等。近年来，肺癌、乳腺癌及结直肠癌等发病呈显著上升趋势，肝癌、胃癌及食管癌等发病率仍居高不下。大部分癌症是人体细胞在外界因素长期作用下，基因损伤和改变长期积累的结果，是一个多因素、多阶段、复杂渐进的过程。目前，治疗肿瘤的主要的手段是通过化疗、放疗等方式杀死肿瘤细胞。近年来，一种新兴的肿瘤治疗手段——肿瘤的免疫治疗受到了越来越多的关注。肿瘤的免疫治疗是通过增加肿瘤细胞的免疫原性，或调动宿主的免疫系统，从而控制和杀伤肿瘤细胞。这种治疗手段是在不破坏机体免疫系统功能的前提下，实现治疗肿瘤的目的。该治疗方法填补了手术、放化疗等常规疗法的不足，不但可特异性杀伤肿瘤细胞，清除体内肿瘤残留病灶，防止肿瘤复发与转移；而且无毒副作用，对病人受损的免疫系统又能起到恢复与重建的独特疗效，在延长患者生命的同时提高了患者的生活质量。热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质，加热、缺氧、病毒感染、重金属中毒、氧化剂等刺激因素都可诱导其表达增加。HSP根据同源程度及分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP及泛素等多个亚家族。Gp96(GRP94)为内质网HSP90家族的代表，与细胞质HSP90高度同源，作为分子伴侣，参与蛋白折叠、蛋白降解、蛋白复合体组装、转运、抗原处理、蛋白定位等生物学过程。随着近年来对Gp96的深入研究发现，Gp96能够与抗原肽结合形成Gp96-多肽复合物，在肿瘤的免疫治疗中起重要作用。在免疫反应过程中，Gp96能够将结合到的抗原肽交叉呈递给MHCI类分子，引起CTL反应，同时Gp96还能诱导DC细胞成熟，释放细胞因子等物质，激活抗肿瘤免疫应答过程。目前为止，这一技术已经运用到胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、神经胶质瘤、肾癌、黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌等实体肿瘤的临床治疗中。虽然运用Gp96-多肽复合物免疫治疗各类肿瘤的临床效果不错，但是对于获取Gp96-多肽复合物存在一定困难。目前为止，Gp96-多肽复合物的来源主要是从患者身上切除的肿瘤组织提取纯化出来，由于肿瘤组织的临床标本不易取得，有时候即使获得肿瘤组织，样本大小和数量也受到了限制，同时Gp96-多肽复合物的提取纯化过程比较复杂，许多时候提取纯化得到的Gp96-多肽复合物量太少，不足以达到足够治疗肿瘤的量，这些条件都大大限制了它的临床应用。
技术实现思路
针对上述问题，如何找到其他来源并能够稳定提取纯化Gp96-多肽复合物和改进Gp96-多肽复合物的提取纯化方式及纯化效率是解决问题的关键，为此，本专利技术提供一种Gp96-多肽复合物的提取纯化方法，本专利技术的方法显著提高了Gp96-多肽复合物的提取纯化获得含量和效率。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下。一种Gp96-多肽复合物的提取纯化方法，包括如下步骤：将人源的离体胎盘组织或肿瘤组织研磨制成匀浆液，然后将该匀浆液离心提取煽情也，将该上清液依次经过Gp96单克隆抗体-Sepharose4B亲和层析、HiTrap-QSepharose离子交换层析提取、纯化，即得。进一步地，所述Gp96-多肽复合物的提取纯化方法包括如下步骤：(1)人源的离体胎盘组织的前处理：将离体胎盘组织去除包膜物质和结缔组织或者以肿瘤组织为原料，然后将胎盘组织或肿瘤组织剪碎，然后加入裂解液，研磨后制成匀浆液；将该匀浆液离心，结束后取上清液，备用。(2)Gp96单克隆抗体-Sepharose4B亲和层析：将步骤(1)得到的上清液上样于Gp96单克隆抗体-Sepharose4B亲和层析柱，然后用缓冲溶液洗脱层析柱，将收集的洗脱液调整至pH＝7.0。(3)HiTrap-QSepharose离子交换层析：将步骤(2)得到的洗脱液上样于HiTrap-QSepharose离子交换层析柱，然后用缓冲溶液洗脱该离子交换层析柱，将收集的洗脱液进行超滤浓缩，得到含有Gp96-多肽复合物的提取物。进一步地，步骤(1)中，如果所述离体胎盘经过冷冻保存，需要先将所述离体胎盘组织解冻，然后再去除包膜物质和结缔组织。进一步地，步骤(1)中，所述裂解液由预冷的NaHCO3和苯甲基磺酰氟(PMSF)组成，裂解液的pH＝7.0；可选地，两者的摩尔比为30：1。进一步地，步骤(1)中进行离心后，将得到的上清液再次进行离心，完成后取上清液进行下一工序；可选地，第一次离心转速为10000rpm，时间为1h，温度为4℃；第二次离心转速为10000rpm，时间为0.5h，温度为4℃，结束后取出上清液，备用。进一步地，步骤(2)中，所述上清液上样流速为0.8mL/min。进一步地，步骤(2)中，所述采用缓冲溶液洗脱层析柱的步骤中，先采用含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液洗脱层析柱；然后以甘氨酸-HCl为洗脱液洗脱层析柱。进一步地，步骤(2)中，采用NaHCO3将收集的洗脱液调整至pH＝7.0。进一步地，步骤(3)中，所述洗脱液的上样流速为1.5mL/min。进一步地，步骤(3)中，采用含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液洗脱层析柱。进一步地，步骤(3)中，采用30KD的膜包对收集的洗脱液进行超滤浓缩，即得含有Gp96-多肽复合物的提取物。相较于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术以人源的离体胎盘或肿瘤组织作为原料，通过Gp96单克隆抗体-Sepharose4B亲和层析和HiTrap-QSepharose离子交换层析得到Gp96-多肽复合物，显著提高了Gp96-多肽复合物的提取纯化获得含量和效率。(2)本专利技术的方法不仅提取效率显著提高，同时在人源离体的胎盘组织中能够得到足够治疗肿瘤的Gp96-多肽复合物的量，也尽量避免和减少提取纯化过程中其他毒副产物的残留。(3)由于本专利技术的提取方法的纯化效率显著提高，因此样本组织也可为离体的肿瘤组织，得到的Gp96-多肽复合物的提取物通过SDS-PAGE检测蛋白的纯度。附图说明构成本专利技术一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例提取的Gp96-多肽复合物的SDS-PAGE图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Gp96-多肽复合物的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：将人源的离体胎盘组织或肿瘤组织研磨制成匀浆液，然后将该匀浆液离心提取煽情也，将该上清液依次经过Gp96单克隆抗体-Sepharose 4B亲和层析、HiTrap-Q Sepharose离子交换层析提取、纯化，即得。/n

【技术特征摘要】
1.一种Gp96-多肽复合物的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：将人源的离体胎盘组织或肿瘤组织研磨制成匀浆液，然后将该匀浆液离心提取煽情也，将该上清液依次经过Gp96单克隆抗体-Sepharose4B亲和层析、HiTrap-QSepharose离子交换层析提取、纯化，即得。


2.一种Gp96-多肽复合物的提取纯化方法，其特征在于，所述Gp96-多肽复合物的提取纯化方法包括如下步骤：
(1)人源的离体胎盘组织的前处理：将离体胎盘组织去除包膜物质和结缔组织或者以肿瘤组织为原料，然后将胎盘组织或肿瘤组织剪碎，然后加入裂解液，研磨后制成匀浆液；将该匀浆液离心，结束后取上清液，备用；
(2)Gp96单克隆抗体-Sepharose4B亲和层析：将步骤(1)得到的上清液上样于Gp96单克隆抗体-Sepharose4B亲和层析柱，然后用缓冲溶液洗脱层析柱，将收集的洗脱液调整至pH＝7.0；
(3)HiTrap-QSepharose离子交换层析：将步骤(2)得到的洗脱液上样于HiTrap-QSepharose离子交换层析柱，然后用缓冲溶液洗脱该离子交换层析柱，将收集的洗脱液进行超滤浓缩，得到含有Gp96-多肽复合物的提取物。


3.根据权利要求2所述的Gp96-多肽复合物的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，如果所述离体胎盘经过冷冻保存，需要先将所述离体胎盘组织解冻，然后再去除包膜物质和结缔组织。


4.根据权利要求2所述的Gp96-多肽复合物的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述裂解液由预冷的Na...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，孟颂东，吕祥涛，
申请(专利权)人：和泓尚医成都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51