本发明专利技术公开了一种嵌合单链分子以及包含该嵌合单链分子的淋巴细胞及其作为免疫治疗药物的用途。该嵌合单链分子包含呈递肽段、B2M蛋白和HLA‑E重链的嵌合分子。本发明专利技术的嵌合单链分子用在I类主要组织相容性抗原(MHC)表达失活的基因工程化淋巴细胞中时，能避免同种异体的免疫排斥；在T细胞内表达本发明专利技术的嵌合单链分子，能避免因I类主要组织相容性抗原缺失导致的宿主NK细胞的杀伤。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种嵌合单链分子及其应用
本专利技术涉及一种嵌合单链分子，尤其是一种包含呈递肽段、B2M蛋白和HLA-E重链的嵌合分子，以及包含该嵌合单链分子的淋巴细胞及其作为免疫治疗药物的用途。
技术介绍
过继性细胞免疫治疗是从人体内将原代的T细胞分离出来，在离体条件下体外刺激、扩增和培养，最终将这些细胞回输给病人，以达到治疗疾病的目的。嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)是目前过继性细胞免疫治疗成功的代表之一。CAR-T疗法是指体外分离激活供体的T细胞，并将包括抗原识别区、共激活区和激活区的CAR基因转入T细胞内，进一步体外大规模扩增后回输给病人，以治疗疾病。现有的CAR-T技术都是个体化的，都使用病人自体的T细胞来生产CAR-T细胞。自体T细胞制备CAR-T细胞有很多缺点，比如生产周期长、制备成本高、很多情况下病人T细胞状态不好等问题。因此CAR-T技术需要突破个体化限制，也就是使用来自于健康供体的异体T细胞作为细胞来源来生产CAR-T细胞，这种细胞没有受体限制，因此被称为通用型CAR-T。通用型的CAR-T的T细胞来自于健康供体，可以提前制备好供任意病人使用。通用型CAR-T的制备要考虑两个问题。一方面，去除供体细胞的I类MHC分子的表达，可以消除供体细胞抗原呈递，逃离宿主T细胞的识别和杀伤，CAR-T细胞得以存活。另外一方面，去除供体细胞TCR复合体的表达，可以防止供体T细胞识别杀伤宿主细胞。I类MHC分子包括两种亚基，称为重链和轻链。因为重链的不同，I类MHC分为A/B/C/E/F/D几种不同种类。轻链是通用性亚基(B2M)，可以和任意一种重链组成I类MHC复合物。I类MHC复合物在细胞内的主要作用是呈递细胞内蛋白降解后的多肽片段，它在细胞内和多肽片段结合后形成多肽-I类MHC复合物，并转运到细胞表面。多肽-I类MHC复合物可以被特异的T细胞克隆的TCR识别，从而导致T细胞的杀伤。TCR由两个亚基构成，alpha(α)亚基和beta(β)亚基。两种亚基都有很多亚型，不同的亚型组合，形成大量不同的TCR克隆。TCR特异表达于T细胞表面，和多种不同的CD3分子结合形成TCR复合物，该复合物可以识别多肽-I类MHC复合物，识别后可以引起T细胞的激活和被识别细胞的杀伤。去除细胞内蛋白表达的方法主要是两种：RNA沉默导致的基因敲低和核酸酶介导的基因编辑技术。RNA沉默导致的基因敲低和基因编辑技术可以在供体T细胞内同时实现I类MHC复合物和TCR复合物的去除。基因编辑技术是使用特异性的稀切核酸内切酶切割细胞内基因组，切割完成后，细胞内固有的非同源重组修复机制发生，该修复为非特异性修复，易产生移码基因突变，从而导致基因敲除。虽然基因敲除可以实现I类MHC复合物表达的去除，避免受体T细胞的攻击，但是同时I类MHC的缺失会引起受体NK细胞的激活杀伤。NK细胞是一种天然免疫监视细胞。NK细胞表面有很多受体，其中包括激活性受体和抑制性受体。激活性受体主要有NKG2D等，NKG2D的配体包括MICA，MICB，ULBP1-6等。抑制性受体主要有KIR，其配体为I类MHC分子。另外，抑制性受体还包括NKG2A，该分子的配体是I类MHC分子家族类似物HLA-E(MorvanandLanier,NatRevCancer2016.16,7-19)。NK细胞是否被激活，取决于激活性信号和抑制性信号的平衡。正常细胞同时表达可以激活和可以抑制NK细胞激活的配体。正常细胞表达的I类MHC复合物与NK细胞抑制性受体结合，从而避免NK细胞的激活和杀伤。缺乏I类MHC复合物的细胞不能结合抑制性受体，导致抑制性受体不能被激活，平衡倾向于激活NK细胞，因此，缺乏I类MHC复合物的细胞可以被NK细胞识别杀伤。很多机制可以避免NK细胞的杀伤。被病毒感染的细胞会表达病毒来源的I类MHC家族蛋白的类似物，该类似物分子可以和抑制性受体NKG2A结合，抑制NK细胞的激活。引入I类MHC家族成员HLA-E分子到细胞内，该分子可以和抑制性受体NKG2A结合，抑制NK细胞的激活(CN106103475A)。另外，在HLAclassInull721.221细胞内，I类MHC分子表达缺失，这种细胞会被NK细胞识别和杀伤。人为导入HLA-E或者HLA-G可以抑制NK细胞的激活，从而避免被NK细胞杀伤。引入免疫抑制性多肽如病毒I类MHC同源物或者NKG2D的配体同样可以抵抗NK细胞的杀伤。由于HLA-E的细胞膜表达依赖于B2M形成复合体，因此在通用型CAR-T抑制或敲除B2M蛋白后，HLA-E不会定位于细胞膜。另外，HLA-E的膜定位还依赖于呈递多肽。一般HLA-E特异呈递HLA-A,-B,-C和-G的信号肽和某些病毒的多肽。人为构建HLA-E嵌合单链分子，可以增加HLA-E/B2M复合体在细胞上的表达。有研究表明，在肿瘤细胞系或多能干细胞中表达递呈HLA-G信号肽的HLA-E嵌合单链分子可以有效地抵抗同种异体NK细胞的杀伤(WO2004/103149A2)。虽然I类MHC分子缺失的细胞表达HLA-E嵌合单链分子可以有效抑制NK细胞的杀伤，但多数的数据集中在模式细胞系、病毒感染的细胞、多能干细胞或是肿瘤细胞。这种HLA-E嵌合单链分子在I类MHC分子缺失的免疫淋巴细胞中的表达尚未有人报道。同一种蛋白在不同类别的组织细胞中的表达模式(是否表达、表达量)和功能可以完全不同，HLA-E嵌合单链分子在免疫淋巴细胞中是否可以高效表达、发挥对NK细胞的抑制功能，尚不清楚。此外，HLA-E重链的不同亚型、HLA-E/B2M复合体所递呈的不同信号肽对HLA-E嵌合单链分子在细胞膜上是否表达、表达量高低和免疫功能至关重要。在不同HLA-E重链亚型和众多呈递肽中筛选出最优的组合，并表达于工程化免疫淋巴细胞，对同种异体的通用型免疫细胞治疗意义重大。本专利技术简述本专利技术涉及一种包含呈递肽段、B2M、HLA-E的嵌合单链分子，可以在B2M缺失的淋巴细胞内实现HLA-E的细胞膜表达。包含呈递肽段、B2M、HLA-E的嵌合单链分子可以进一步应用于缺失TCR和B2M的通用型CAR-T，避免NK细胞的杀伤。本专利技术提供了如下技术方案：1.一种嵌合单链分子，所述嵌合单链分子包含：(a)呈递肽段；(b)B2M蛋白；(c)HLA-E重链；和(d)连接序列，该连接序列用于连接前述(a)和(b)，以及(b)和(c)片段；其中HLA-E重链为HLA-E*01:01或HLA-E*01:03亚型。2.技术方案1所述的嵌合单链分子，所述嵌合单链分子N端到C端依次包含：呈递肽段-连接序列-B2M蛋白-连接序列-HLA-E重链。3.技术方案1或2所述的嵌合单链分子，其中，所述呈递肽段是I类MHC分子的信号肽。4.技术方案3所述的嵌合单链分子，其中，所述呈递肽段包含或者是选自下述序列中的一个：SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。5.技术方案4所述的嵌合单链分子，其中，所述呈递肽段是SEQIDNO:5所示。6.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合单链分子，所述嵌合单链分子包含：(a)呈递肽段；(b)B2M蛋白；(c)HLA-E重链；和(d)连接序列，该连接序列用于连接前述(a)和(b)，以及(b)和(c)片段；其中HLA-E重链为HLA-E*01:01或HLA-E*01:03亚型。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180611 CN 2018105953469一种嵌合单链分子，所述嵌合单链分子包含：(a)呈递肽段；(b)B2M蛋白；(c)HLA-E重链；和(d)连接序列，该连接序列用于连接前述(a)和(b)，以及(b)和(c)片段；其中HLA-E重链为HLA-E*01:01或HLA-E*01:03亚型。
权利要求1所述的嵌合单链分子，所述嵌合单链分子N端到C端依次包含：呈递肽段-连接序列-B2M蛋白-连接序列-HLA-E重链。
权利要求1或2所述的嵌合单链分子，其中，所述呈递肽段是I类MHC分子的信号肽。
权利要求3所述的嵌合单链分子，其中，所述呈递肽段包含或者是选自下述序列中的一个：SEQIDNO:2，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。
权利要求4所述的嵌合单链分子，其中，所述呈递肽段是SEQIDNO:5所示。
前述任一项所述的嵌合单链分子，其中，所述连接序列为(EAAAK)n或(GGGGS)n，其中n＝3或4或5。
权利要求6所述的嵌合单链分子，所述的连接序列选自下述序列中的一个或多个：SEQIDNO:8和SEQIDNO:9。
前述任一项所述的嵌合单链分子，其中，所述HLA-E*01:01亚型为SEQIDNO:12或其变体。
前述任一项所述的嵌合单链分子，其中，所述HLA-E*01:03亚型为SEQIDNO:13或其变体。
前述任一项所述嵌合单链分子为SEQIDNO：18、SEQIDNO：22、SEQIDNO：23、SEQIDNO：24或SEQIDNO：25所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：黄倬，林彦妮，郑小翠，孔红梅，
申请(专利权)人：苏州克睿基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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