TGF-βRII突变体及其融合蛋白制造技术

本发明专利技术针对TGF

【技术实现步骤摘要】
TGF
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β RII突变体及其融合蛋白
[0001]本专利申请要求于2020
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07
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24日提交的申请号为202010721371.4的中国专利申请的优先权益，在此将其全部内容引入作为参考。


[0002]本专利技术涉及生物制药领域，特别是肿瘤治疗性蛋白药物领域，具体而言，本专利技术涉及一种TGF
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β RII突变体、其融合蛋白及应用。

技术介绍

[0003]程序性死亡因子配体1(PD
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L1)又称分化簇274(CD274)或B7同源蛋白1(B7
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H1)，属于B7家族成员，由CD274基因编码。成熟的PD
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L1蛋白大小为40kDa，是由272个氨基酸组成的一型跨膜蛋白，诱导表达于激活的T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓来源的肥大细胞和非造血细胞的表面上，在肿瘤组织上广泛表达，如肺癌，肝癌，膀胱癌等。在干扰素及其他炎症因子刺激应答的肿瘤组织和其他组织中都可能会迅速上调。PD
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L1的受体为程序性死亡蛋白1(PD
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1)，也被称为CD279，是T细胞受体CD28家族的成员，表达于多种免疫细胞，如激活的T细胞、B细胞及单核细胞等表面。PD
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L1与其受体PD
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1结合后，可诱导T细胞凋亡、失能、耗竭，进而抑制肿瘤抗原特异性T细胞的激活、增殖和抗肿瘤功能，实现肿瘤免疫逃逸。PD
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1/PD
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L1阻断型抗体可以解除PD
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L1的免疫抑制作用，增强体内免疫细胞如T细胞等对肿瘤细胞的识别和杀伤，从而达到杀灭肿瘤的作用。目前，全球范围内已上市多个靶向PD
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1/PD
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L1的抗体类药物，在临床上对黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞癌和尿路上皮癌等多种肿瘤显示出不错的治疗效果。但是，PD
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1/PD
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L1治疗性抗体还存在一些问题，最主要的问题是临床上单独使用有效率偏低，对于绝大多数癌种来说，如果不加选择地单独使用，有效率平均只有10％
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20％。因此需要开发更加有效的抗体类药物分子以满足临床需求。
[0004]转化生长因子
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β(transforming growth factor
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β,TGF
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β)是TGF
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β超家族的一员，主要功能是调节细胞的生长和分化。TGF
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β在细胞表面有高亲和力受体(TGF
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β R)，分为3个亚型：TGF
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β RI、TGF
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β RII、TGF
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β RIII。TGF
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β通过与细胞膜表面具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的TGF
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β RII结合形成复合物后，再与TGF
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β RI形成复合物，进而传导信号，引起相应信号通路的激活，从而起到调节细胞增殖、分化和凋亡的功能。在肿瘤微环境中，TGF
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β具有调控调节性T细胞(Tregs)发育，抑制DC细胞的成熟，抑制B细胞产生IgA，抑制NK细胞的激活等作用，进而产生免疫抑制，促进肿瘤细胞生长以及转移。通过阻断TGF
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β与其主要受体TGF
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β RII结合，可以抑制TGF
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β的促肿瘤活性。因此开发TGF
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β阻断型药物是肿瘤治疗的一个重要方向。
[0005]目前以TGF
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β通路为靶点的小分子抑制剂和大分子蛋白药物多个处于临床研究阶段，并且在与PD
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1/PD
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L1抗体药物联用方面有多个临床试验在进行中(表1)，且有文献对联用的机制进行了深入的探索。(Nature.2018 Feb 22.doi:10.1038/nature25492；Nature.2018Feb 22.doi:10.1038/nature25501)。因此开发可以阻断PD
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1/PD
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L1和TGF
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β/
TGF
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β
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R双通路的疗法或药物，有望进一步解决肿瘤微环境免疫抑制的难题。
[0006]在TGF
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β阻断剂与PD
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1/PD
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L1抑制剂联用的基础上，进一步发展了同时阻断PD
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1/PD
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L1和TGF
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β/TGF
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β
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R双通路的药物。Merck&GSK的PD
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L1抗体与TGF
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β RII形成的双功能抗体M7824的临床数据显示其对多种实体瘤具有确切的临床治疗效果(NCT02699515、NCT02517398、NCT03427411)。针对M7824的结构Merck申请了多项专利，见WO2015118175A2。陆续一些类似结构的双功能抗体，如恒瑞的SHR
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1701也进入临床试验阶段(CTR20182404\CTR20181823)。目前已有抗体/TGF
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βRII融合蛋白公开的专利，如WO2006074451A2、W02009152610A1、WO9309228A1、WO9409815A1、WO2015118175A2等，但一些融合蛋白存在不稳定的问题。在实际生产和应用中，仍需要开发更稳定和表达更高的抗体/TGF
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β R融合蛋白。
[0007]尽管M7824具有良好的抗肿瘤效果，但在生产过程中存在TGFβ RII断裂的问题，为其在生产过程中的工艺和质量控制带来一定的难度。针对这一问题，恒瑞医药对TGFβ RII进行了截断体的设计，专利WO2018/205985 A1研究发现，将TGFβ RII的N端前26位氨基酸的截断体，尤其是14
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21位氨基酸的缺失，可保持对TGFβ RII的生理学功能，且具有更好的稳定性。抗体/TGFβ RII融合蛋白中与抗体部分相比TGFβ RII部分的分子较小，在融合蛋白中TGFβ RII的功能易受到抗体分子的干扰甚至屏蔽，即使采用柔性linker也仅是一定程度上缓解该状况。将TGFβ RII的N端截短则会进一步加剧抗体/TGFβ RII融合蛋白分子中两个功能部分之间分子大小的差异程度。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题是：现有技术中抗体/TGFβ RII融合蛋白在生产过程中容易发生断裂和降解、使用N端截断的TGFβ RII则会进一步加剧抗体/TGFβ RII融合蛋白两个功能部分的分子大小差异。
[0009]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TGF
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βRII突变体，其特征在于与野生型TGF
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βRII相比，所述TGF
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βRII突变体在一个或多个选自由以下位点所组成的组中的氨基酸残基位点处存在突变：第6位、第12位、第20位；其中，所述野生型TGF
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βRII的氨基酸残基编码顺序根据SEQ ID NO:6确定。2.如权利要求1所述TGF
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βRII突变体，其特征在于所述突变体相对于野生型TGF
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βRII具有选自下组中的一种或几种突变：Q6N，D12T，G20T。3.如权利要求1所述TGF
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βRII突变体，其特征在于其能够结合TGF
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β，所述TGF
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β包括TGF
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β1、TGF
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β2、TGF
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β3。4.如权利要求1所述TGF
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βRII突变体，其特征在于与野生型TGF
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βRII相比，所述TGF
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βRII突变体在重组表达时具有更少的断裂和/或降解。5.一种融合蛋白，其包括两个或更多个功能片段，其中至少一个功能片段具有权利要求1
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4任一所述TGF
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βRII突变体的氨基酸序列。6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于所述两个或更多个功能片段各自独立的发挥功能；可选的，各功能片段之间通过多肽接头(Linker)连接。7.如权利要求5
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6任一所述融合蛋白，其特征在于所述功能片段还包括抗体或其抗原结合部分、受体或其配体结合部分、细胞因子或其片段、细胞毒素或其变体、标记物或示踪物等。8.如权利要求5
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6任一所述融合蛋白，其特征在于所述功能片段特异性结合选自以下组中的靶点：肿瘤或癌症免疫治疗靶点、慢性感染性疾病免疫治疗靶点、自身免疫性疾病治疗靶点。9.如权利要求8所述融合蛋白，其特征在于所述靶点包括包括表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、胰岛素受体(InsR)、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)、HER2、CTLA、CD20、CD52、CD30、CD33、CD133、PD
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1、PD
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L1、Src、Abl、磷酯酰肌醇3
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激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)、雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)、丝苏氨酸蛋白激酶Ras、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、STAT1、STAT3、STAT5等。10.一种多功能活性分子，其具有两种或更多种功能活性，其中至少一种功能活性为TGF
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β结合活性，且所述TGF
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β结合活性由具有权利要求1
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4任一所述TGF
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βRII突变体的氨基酸序列的多肽片段带来。11.如权利要求10所述多功能活性分子，其特征在于，所述功能活性还包括抗原结合活性、配体结合活性、细胞因子活性、细胞毒性、标记活性。12.如权利要求10
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11任一所述多功能活性分子，其特征在于所述功能活性还包括对以下分子的结合活性，表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、胰岛素受体(InsR)、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)、HER2、CTLA、CD20、CD52、CD30、CD33、CD133、PD
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1、PD
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L1、Src、Abl、磷酯酰肌醇3
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激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)、雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)、丝苏氨酸蛋白激酶Ras、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、STAT1、STAT3、STAT5等。13.一种抗体
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TGF
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βRII缀合分子，其中所述抗体靶向肿瘤治疗靶点，所述TGF
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βRII具有权利要求1
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4任一所述TGF
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βRII突变体的氨基酸序列。14.如权利要求13所述抗体
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TGF
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βRII缀合分子，其中所述抗体特异性靶向表皮生长因
子受体(EGFR)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、胰岛素受体(InsR)、布鲁顿酪氨酸激酶(BTK)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锦超，王双，焦莎莎，张畅，王荣娟，曾大地，
申请(专利权)人：迈威上海生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：