包含靶结合结构域的核酶制造技术

本申请公开了一种包含靶结合结构域的核酶，所述靶结合结构域用于结合靶RNA分子。所述核酶进一步包含一个或多个催化结构域和侧翼为两个核酶切割位点的一个或多个可释放RNA区段，其中通过靶RNA分子的催化结构域的激活导致在核酶切割位点的切割，这导致可释放RNA区段从核酶中释放。本申请进一步公开了所述核酶用于检测靶RNA分子的存在或扩增靶RNA分子的用途。用途。用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含靶结合结构域的核酶
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求保护2019年4月12日提交的新加坡临时申请号10201903323U的优先权的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中以用于所有目的。
专利

[0003]本专利技术涉及生物化学领域，具体而言涉及分子生物学领域。具体而言，本专利技术涉及经工程改造以包含一个或多个靶结合结构域的核酶。
[0004]专利技术背景
[0005]尽管常认为RNA仅作为遗传而得的遗传密码(DNA)及其功能输出(蛋白质)之间的中间信使，但目前非常清楚的是，细胞和个体中的编码和非编码RNA二者的水平和概况，在其信使功能之外还展示大量信息。尽管医生传统上依赖病史、症状、活组织检查及其他操作来形成诊断，但随着先进测序和个性化用药的出现，检测和测定各种类型的RNA分子目前对于指导临床决策而言日渐重要。
[0006]特别关注的一类RNA分子为微小RNA(miRNA)。miRNA为结合并下调靶mRNA的内源短链非编码RNA，其在许多人类疾病中为失调的。miRNA表达特征(signature)与患者诊断、疾病分期、预后和应答相关。重要的是，发现miRNA在血液中循环，这允许以最小程度的侵入式操作来对其检测。与疾病和治疗应答的miRNA特征有关的数据持续增加，以及至今已有超过100项临床试验并入miRNA作为生物标志物。尽管有用于测定miRNA的临床方法(大部分基于RT
‑
qPCR)，但由于生物样品(例如血清)中的miRNA的浓度常常极低，所以在检测之前，样品常常首先需要RNA纯化和浓缩。这些操作需要经由DNA中间体的反转录。因此，无需使用蛋白酶或利用DNA中间体便可在生物样品中直接扩增靶miRNA或放大其信号的工具和方法，可提升我们进行廉价且有效的RNA检测的能力。
[0007]检测RNA分子的能力亦对诊断病毒感染极其重要。存在至少47个RNA病毒家族。数个RNA病毒家族导致具有重大疾病负荷的疾病：严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS
‑
CoV
‑
2)(其导致COVID
‑
19)、埃博拉、SARS、西尼罗热、丙型肝炎、流行性感冒和麻疹，而其他RNA病毒家族与导致严重作物减产的植物病毒相关，例如马铃薯Y病毒(PVY)。在病毒性疾病爆发期间，用于诊断的灵敏、方便、可靠且迅速的方法对于快速遏制而言为至关重要的。目前用于诊断RNA病毒感染的常规方法主要基于PCR(尤其是用于新型病毒；虽然可开发血清学检验，但通常并非广泛使用的)，且需要首先将样品中的RNA分离并反转录成cDNA，然后用特异性引物扩增，之后使用荧光染料用RT
‑
qPCR检测扩增产物。这需要昂贵的试剂、专业的设备和先进的技能组合来进行分析。因为样品必须送至专业实验室，所以这减慢了爆发期间的诊断。如DETECTR(Chen等，CRISPR
‑
Cas12a靶结合释放无差别单链DNA酶活性(CRISPR
‑
Cas12a target
‑
binding unleashes indiscriminate single
‑
stranded DNase activity).Science 2018)和SHERLOCK(Gootenberg,J.S.等，使用Cas13、Cas12a和Csm6的多重便携式核酸检测平台(Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13,Cas12a,and Csm6).Science 360，439
‑
444，doi:10.1126/
science.aaq0179(2018))等基于CRISPR的技术显示床旁(point
‑
of care,POC)检测的前景，但需要使用昂贵的等温扩增酶和CRISPR试剂的扩增。在开发用于病毒RNA的低成本诊断的过程中的主要障碍为缺少无需酶和通过DNA中间体便可直接扩增和检测RNA的方法。
[0008]总之，需要提供用于扩增和检测靶RNA分子或其信号的简单且有效的工具，这将使用于不同诊断应用的RNA标志物和病毒RNA的快速有效检测成为可能。
[0009]专利技术概述
[0010]在一方面，本公开内容涉及一种核酶，其包含：a)一个或多个催化结构域，所述催化结构域能够在活性状态和无活性状态之间转换；b)一个或多个可释放RNA区段，其中所述可释放RNA区段各自侧翼为两个核酶切割位点，其中每个切割位点被活性状态的一个或多个催化结构域的至少一个切割；c)一个或多个靶结合结构域，所述一个或多个靶结合结构域的每个用于结合靶RNA分子；其中所述一个或多个催化结构域的每个与所述一个或多个靶结合结构域之一连接，其中当与催化结构域连接的靶结合结构域未结合靶RNA分子时，所述催化结构域呈无活性状态，而其中当与催化结构域连接的靶结合结构域结合了靶RNA分子时，所述催化结构域呈活性状态；以及其中当位于可释放RNA区段侧翼的两个切割位点均被所述一个或多个催化结构域切割时，所述一个或多个可释放RNA区段从所述核酶中释放。
[0011]在另一方面，本公开内容涉及检测样品中靶RNA分子的存在的方法，其中所述方法包括：a)将样品与本公开内容的核酶一起在温度T1孵育，这允许靶RNA分子的与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合；b)将样品在温度T2孵育，这允许靶RNA分子和可释放RNA区段从所述核酶中释放；c)检测可释放RNA区段从所述核酶中的释放。
[0012]在又另一方面，亦提供了扩增靶RNA分子的方法，其中所述方法包括：a)将靶RNA分子与本公开内容的核酶一起在温度T1孵育，这允许所述靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合，以及其中可释放RNA区段包含与所述靶RNA分子一致的序列；b)将结合靶RNA分子的核酶在温度T2孵育，这允许所述靶RNA分子和RNA区段从所述核酶中释放。在另一个实施例中，将步骤a)至b)重复一次或多次，其中从步骤b)释放的靶RNA分子和可释放RNA区段用于结合所述核酶的另一个拷贝。
[0013]在又另一方面，提供了在受试者中诊断疾病的方法，所述方法包括：a)获得来自受试者的样品；b)将所述样品与本公开内容的核酶一起在温度T1孵育，这允许疾病相关的靶RNA分子与包含在所述核酶中的一个或多个靶结合结构域结合；c)将所述样品在温度T2孵育，这允许所述靶RNA分子和可释放RNA区段从所述核酶中释放；d)检测来自所述核酶的可释放RNA区段的水平。
[0014]在又另一方面，提供了编码本公开内容的核酶的多核苷酸。在其中核酶由多于一条RNA链组成的一些实施例中，所述RNA链可由一个多核苷酸一起编码或者由数个多核苷酸独立编码。
[0015]在另一方面，进一步提供了包括本公开内容的核酶的试剂盒。
[0016]附图简述
[0017]当结合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酶，其包含：a)一个或多个催化结构域，所述催化结构域能够在活性状态和无活性状态之间转换；b)一个或多个可释放RNA区段，其中所述可释放RNA区段各自侧翼为两个核酶切割位点，其中每个切割位点被活性状态的一个或多个催化结构域的至少一个切割；c)一个或多个靶结合结构域，所述一个或多个靶结合结构域的每个用于结合靶RNA分子；其中所述一个或多个催化结构域的每个与所述一个或多个靶结合结构域之一连接；其中当与催化结构域连接的靶结合结构域未结合靶RNA分子时，所述催化结构域为无活性状态的，而其中当与催化结构域连接的靶结合结构域结合了靶RNA分子时，所述催化结构域呈活性状态；和其中当位于可释放RNA区段侧翼的两个切割位点均被所述一个或多个催化结构域切割时，所述一个或多个可释放RNA区段从核酶中释放。2.根据权利要求1所述的核酶，其进一步包含一个或多个抑制结构域；其中所述一个或多个催化结构域的至少一个与所述一个或多个抑制结构域之一连接，其中所述催化结构域因来自抑制结构域的抑制而呈无活性状态，所述抑制结构域与所述一个或多个靶结合结构域之一连接；其中当一个或多个靶结合结构域之一与靶RNA分子结合时，与所述靶结合结构域连接的抑制结构域停止抑制与所述抑制结构域连接的所述催化结构域，这导致所述催化结构域转换成活性状态。3.如权利要求1所述的核酶，其中所述核酶包含一个催化结构域和一个靶结合结构域，其中所述核酶包含以下结构：其中[A]至[a]为5
’
至3
’
方向性的或3
’
至5
’
方向性的，且其中：基序[A]和[a]构成用于结合靶RNA分子的所述靶结合结构域；基序[C]和[c]构成所述催化结构域；基序[D]包含能够被所述催化结构域切割的第一切割位点；基序[D
’
]包含能够被所述催化结构域切割的第二切割位点；基序[E]包含可释放RNA区段；基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；每个连接基序的水平线代表任选的接头区；和其中当所述靶结合结构域与靶RNA分子结合时，所述催化结构域呈活性状态。4.如权利要求2所述的核酶，其中所述核酶包含一个催化结构域、一个抑制结构域和一个靶结合结构域，其中所述核酶包含具有以下结构的RNA链：
其中[A]至[a]为5
’
至3
’
方向性的或3
’
至5
’
方向性的，且其中：基序[A]和[a]构成用于结合靶RNA分子的所述靶结合结构域；基序[B]和[b]构成所述抑制结构域；基序[C]和[c]构成第一催化结构域；基序[D]包含能够被所述催化结构域切割的第一切割位点；基序[D
’
]包含能够被所述催化结构域切割的第二切割位点；基序[E]包含可释放RNA区段；基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；每个连接基序的水平线代表任选的接头区；和其中所述抑制结构域特征在于以下i)或ii)：i)当所述靶结合结构域未结合靶RNA分子时，基序[b]与[C]退火结合，而当靶结合结构域结合靶RNA分子时，基序[b]与[B]退火结合，ii)当第一靶结合结构域未结合靶RNA分子时，基序[B]与基序[c]退火结合，而当靶结合结构域结合靶RNA分子时，基序[B]与[b]退火结合，其中当基序[b]与基序[B]退火结合时，所述催化结构域呈活性状态。5.如权利要求1或2所述的核酶，其中所述核酶包含两个催化结构域。6.如权利要求5所述的核酶，其中所述核酶包含两个靶结合结构域。7.如权利要求5或6所述的核酶，其中所述核酶包含第一RNA链和第二RNA链。8.如权利要求7所述的核酶，其中所述核酶包含以下结构：S1S2其中：S1为第一RNA链和S2为第二RNA链，其中[A]至[A
’
]和[a]至[a
’
]代表相反的方向性；其中基序[A]和[a]构成用于结合第一靶RNA分子的第一靶结合结构域；基序[C]和[c]构成第一催化结构域；基序[D]包含能够被所述第一催化结构域切割的第一切割位点；基序[A
’
]和[a
’
]构成用于结合第二靶RNA分子的第二靶结合结构域；基序[C
’
]和[c
’
]构成第二催化结构域；基序[D
’
]包含能够被所述第二催化结构域切割的第二切割位点；基序[E]包含可释放RNA区段；
基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；每个连接基序的水平线各自代表任选的接头区；和其中当所述第一靶结合结构域与所述第一靶RNA分子结合时，所述第一催化结构域呈活性状态；和其中当所述第二靶结合结构域与所述第二靶RNA分子结合时，所述第二催化结构域呈活性状态。9.如权利要求2所述的核酶，其中所述核酶包含以下结构：S1S2其中：S1为第一RNA链和S2为第二RNA链，其中[A]至[A
’
]和[a]至[a
’
]代表相反的方向性；其中基序[A]和[a]构成用于结合第一靶RNA分子的第一靶结合结构域；基序[B]和[b]构成抑制结构域；基序[C]和[c]构成第一催化结构域；基序[D]包含能够被第一催化结构域切割的第一切割位点；基序[A
’
]和[a
’
]构成用于结合第二靶RNA分子的第二靶结合结构域；基序[C
’
]和[c
’
]构成第二催化结构域；基序[D
’
]包含能够被所述第二催化结构域切割的第二切割位点；基序[E]包含可释放RNA区段；基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的序列；每个连接基序的水平线代表任选的接头区；其中所述抑制结构域特征在于以下i)或ii)：i)当所述第一靶结合结构域未结合所述第一靶RNA分子时，基序[b]与[C]退火结合，而当所述第一靶结合结构域结合所述第一靶RNA分子时，基序[b]与[B]退火结合，ii)当所述第一靶结合结构域未结合所述第一靶RNA分子时，基序[B]与基序[c]退火结合，而当所述第一靶结合结构域结合所述第一靶RNA分子时，基序[B]与[b]退火结合；其中当基序[b]与基序[B]退火结合时，所述第一催化结构域呈活性状态。10.如权利要求4或9所述的核酶，其中所述抑制结构域进一步特征在于以下i)或ii)：i)基序[b]与基序[C]至少50％互补，且与基序[B]至少20％互补，和ii)基序[B]与基序[c]至少50％互补，且与基序[b]至少20％互补。11.如权利要求2所述的核酶，其中所述核酶包含以下结构：S1S2S2其中：S1为第一RNA链和S2为第二RNA链，其中[A]至[A
’
]和[a]至[a
’
]代表相反的方向性；其
中基序[A]和[a]构成用于结合第一靶RNA分子的第一靶结合结构域；基序[B]和[b]构成第一抑制结构域；基序[C]和[c]构成第一催化结构域；基序[D]包含能够被所述第一催化结构域切割的第一切割位点；基序[A
’
]和[a
’
]构成用于结合第二靶RNA分子的第二靶结合结构域；基序[B
’
]和[b
’
]构成第二抑制结构域；基序[C
’
]和[c
’
]构成第二催化结构域；基序[D
’
]包含能够被所述第二催化结构域切割的第二切割位点；基序[E]包含可释放RNA区段；基序[e]包含任选与基序[E]的序列互补的...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯诗盈，高崇慧，林妤庭，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：