一种引物组合物及其应用制造技术

本申请提供了一种引物组合物及其应用，所述引物组合物包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。采用本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增五灵脂及其混伪品的线粒体基因组Cytb基因序列，经测序后与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因序列进行比对，从而实现五灵脂及其混伪品的准确鉴定。及其混伪品的准确鉴定。及其混伪品的准确鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合物及其应用
[0001]本申请要求于2021年9月2日提交中国专利局、申请号为202111026854.3专利技术名称为“一种引物组合物及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本申请涉及五灵脂及其混伪品的鉴定
，特别是涉及一种引物组合物及其在鉴定五灵脂及其混伪品中的应用。

技术介绍

[0003]五灵脂，又名血灵脂、草灵脂、五灵子、寒雀粪、寒号鸟屎，是鼯鼠科复齿鼯鼠(Trogopterus xanthipes)的干燥粪便，主产于山西太行山、五台山地区及河北等地。五灵脂性温，味咸、甘，归肝经，具有活血、散瘀、止血、止痛的功效。现代药理学研究表明，五灵脂具有抗炎、抗溃疡、抗血小板聚集、提高免疫等方面的药理活性，在临床上被广泛地应用于心脑血管疾病、妇科疾病、慢性胃炎、胃溃疡等的治疗。
[0004]五灵脂的基原动物是其真伪的判断标准，混伪品的存在在一定程度上影响了五灵脂临床用药的安全性，但现有鉴定混伪品的方法，如来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定等，会受到主观因素的影响，无法完全满足目前中药鉴定的需求。因此，亟需一种更加客观准确的鉴定方法。

技术实现思路

[0005]本申请的目的在于提供一种引物组合物，以通过对五灵脂及其混伪品的线粒体基因组Cytb基因序列的特异性扩增，经测序后与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因序列进行比对，实现五灵脂及其混伪品的准确鉴定。
[0006]本申请第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本申请第二方面提供了本申请第一方面提供的引物组合物在鉴定五灵脂及其混伪品中的用途。
[0008]本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物鉴定五灵脂及其混伪品的方法，包括以下步骤：
[0009]1)提取待测样品的总DNA；
[0010]2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
[0011]3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
[0012]4)将步骤3)获得的基因序列与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因序列进行比对，鉴定所述待测样品为五灵脂或其混伪品。
[0013]本申请第四方面提供了一种用于鉴定五灵脂及其混伪品的试剂盒，所述试剂盒中包括本申请第一方面提供的引物组合物。
[0014]本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增五灵脂及其混伪品的线粒体基因组Cytb基因序列，经测序后与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因序列进行比对，从而实现五灵脂及其混伪品的准确鉴定。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
[0016]图1显示了各待测样品总DNA的PCR扩增结果的序列相对丰度热图。
[0017]图2显示了各中成药样品总DNA的PCR扩增结果的序列相对丰度热图。
具体实施方式
[0018]下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0019]本申请第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物为5
’‑
AGCATGATGAAATTTTGGTTCCCTC
‑3’
(SEQ ID NO:1)，所述反向引物为5
’‑
TAAGTCAGCCGTAATTTACATCTCG
‑3’
(SEQ ID NO:2)。
[0020]本申请第二方面提供了本申请第一方面提供的引物组合物在鉴定五灵脂及其混伪品中的用途。
[0021]在本申请中，采用本申请的引物组合物鉴定五灵脂及其混伪品，是通过鉴定五灵脂或其混伪品的基原动物，从而实现的五灵脂或其混伪品的鉴定。专利技术人在研究中发现，本申请的引物组合物，能够同时用于扩增五灵脂及其常见伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因，因此，如果五灵脂药材中混有伪品，对药材的总DNA进行PCR扩增的产物中就会出现其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因片段；以五灵脂及其混伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因为各自的特征序列，通过鉴定扩增结果中是否存在其伪品的基原动物的特征序列，即可鉴定五灵脂的真伪；其中，所述五灵脂的基原动物为复齿鼯鼠，所述混伪品的基原动物包括但不限于红白鼯鼠、小飞鼠、黑白飞鼠、豚鼠、山羊、毛足飞鼠、大飞鼠、栗褐鼯鼠、黄羊、青羊和红耳鼠兔中的至少一种。
[0022]本申请第三方面提供了一种采用本申请第一方面提供的引物组合物鉴定五灵脂及其混伪品的方法，包括以下步骤：
[0023]1)提取待测样品的总DNA；
[0024]2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；
[0025]3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
[0026]4)将步骤3)获得的基因序列与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因序列进行比对，鉴定所述待测样品为五灵脂或其混伪品。
[0027]本申请中，对待测样品总DNA的提取方法不做限定，只要能够实现本申请的目的即
可，例如可以采用市售的粪便基因组提取试剂盒即可，如TIANGEN公司的粪便基因组提取试剂盒。
[0028]在步骤4)中，所述五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因序列，可以通过常用的基因数据库进行搜索获得，例如由GenBank数据库搜索获得。
[0029]对待测样品的总DNA进行PCR扩增可采用常规的PCR扩增体系，例如25μL扩增体系或50μL扩增体系等，本申请在此不做限定。
[0030]在本申请第三方面的一些实施方式中，PCR扩增体系中包括：
[0031]0.1
‑
0.3μmol/L正向引物；0.1
‑
0.3μmol/L反向引物；2
‑
10ng/μL模板DNA；50
‑
150μmol/L dNTPs；0.02
‑
0.03U/μL DNA聚合酶。
[0032]dNTPs以及DNA聚合酶均为PCR体系的常规通用试剂，均可市售获得。DNA聚合酶可以选择PCR扩增用的常规DNA聚合酶，本申请在此不做限定，例如Gflex DNA聚合酶。
[0033]当然，所述PCR扩增体系中还包括P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。2.权利要求1所述的引物组合物在鉴定五灵脂及其混伪品中的用途。3.一种采用权利要求1的引物组合物鉴定五灵脂及其混伪品的方法，包括以下步骤：1)提取待测样品的总DNA；2)采用所述引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；4)将步骤3)获得的基因序列与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组Cytb基因序列进行比对，鉴定所述待测样品为五灵脂或其混伪品。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系中包括：0.1
‑
0.3μmol/L正向引物；0.1
‑
0.3μmol/L反向引物；2
‑
10ng/μL模板DNA；50
‑
150μmol/LdNTPs；0.02
‑
0.03U/μL DNA聚合酶。5.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐流巍，田晓轩，孙丽冉，杨霞，杨文志，吴红华，张鹏，李雪，王跃飞，王彧，陈璐，王丹，刘梦扬，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：