一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物制造技术

本发明专利技术公开了一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物。所述引物包括CIAV

【技术实现步骤摘要】
一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，特别涉及一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒及引物。

技术介绍

[0002]鸡传染性贫血病(chicken infectious anemia，CIA)是由鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)引起鸡的再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩为主要特征的免疫抑制病。CIAV为圆环病毒科，圆环形病毒属的环状单股DNA病毒，无囊膜，呈二十面体对称结构，是目前已知基因组最小的病毒之一。该病毒自1979年首次被日本报道以来，此后陆续在美国、英国、澳大利亚、德国、丹麦等国家也出现了相关报道。1992年我国科学家首次分离到该病毒。近年来，随着相关人员的深入研究与数据积累，对CIAV已有一定的理解，但还需要更多的流行病学调查与病毒相关致病机理等方面的深入研究，才有助于尽早消灭该病对于养禽业的影响。
[0003]针对CIAV的检测技术目前主要分为以下6种。
[0004]病毒分离鉴定：病毒分离培养是CIAV鉴定中常用的方法之一。一般情况采集疑似病鸡的肝脏、脾脏、法氏囊等器官组织，碾磨后离心取上清液进行鸡胚、细胞或者动物接种实验进行病源分离。CIAV可在在马立克氏病肿瘤细胞系MDCC
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MSBl、MDCC
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JP2、MDCC
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RPl细胞系正常生长，目前普遍使用MDCC
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MSB1传代细胞或者SPF鸡胚进行病毒体外培养。需要花费较长时间才能完成分离和培养的完整流程。
[0005]电镜观察：直接电镜观察主要用于对粪便、组织培养物中病毒的定性和新分离毒株进行鉴定，也可通过纯化细胞培养液中的病毒粒子，再经过负染后进行电镜观察。但由于CIAV病毒粒子小，并且无论是感染易感动物还是接种于敏感细胞，获得的病毒效价都比较低，因此直接进行电镜观察很难见到病毒粒子。而免疫电镜(IEM)观察比直接电镜观察的敏感性更高，病毒是免疫复合物的聚集状态，对传统电镜观察粒子较小病毒分辨率不足的缺点进行大幅改进。分离、纯化、培养等步骤较为耗时，同时电镜设备昂贵，不利于该技术的推广使用。
[0006]血液学检测：对疑似病鸡采集血液，加入抗凝剂，随后取1mL抗凝血加入红细胞压积管中，以3000rpm离心30min。红细胞压积值低于27％且刨检病鸡出现骨髓黄染则可确诊。
[0007]病毒中和试验(Virus Neutralization Test,VN)：病毒中和试验可有效检测CIAV抗原与抗体效价，SPF鸡或CIAV适应细胞系进行试验均可。但其对标准品的准确性与相关试验人员的操作技术具有一定门槛，容易出现假阴性或假阳性，导致其在基层推广检测过程中结果的可靠性与稳定性容易出现问题，影响最终判断。
[0008]酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)：酶联免疫吸附试验是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。实际生产中可从疑似或待测鸡群进行血液采集，分离血清后，使用商品化的CIA抗体检测试剂盒进行检测，虽然该方法易于进行大批量检测，
且准确性和高效性较中核试验都有所提高，但无法判断待测鸡群处于发病初期、后期还是耐过。
[0009]间接免疫荧光抗体试验(Indirect Immunoinfluscent Assay，IFA)：一种利用特异性抗体标记抗原，继而利用带有荧光信号的抗原与其特异性结合从而进行定位和定量分析的试验。该方法在免疫组化与病毒的初期鉴定分离具有定位定量、操作简便与反应时间短等优点，但应设立准确的阳性血清、阴性血清和非CAM感染细胞作对照，以排除非特异性荧光和可能掩盖特异性反应的背景染色。

技术实现思路

[0010]本专利技术目的在于提供一种鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR快速检测体系，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
[0011]本专利技术的第一目的在于提供一组引物对，包括：
[0012]CIAV
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124
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F：5
’‑
TGCCGGTTCTTTAATCACCC
‑3’
(SEQ ID NO.1)，
[0013]CIAV
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124
‑
R：5
’‑
ATCCCTCATTCTTAGTGGCAA
‑3’
(SEQ ID NO.2)。
[0014]前述的引物对能够特异性扩增CIAV的VP1基因，扩增标靶属于高保守性的基因片段，序列如SEQ ID NO.3所示，长度124bp。
[0015]本专利技术的第二目的在于提供一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒，包括前述的引物对CIAV
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124
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F和CIAV
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124
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R。
[0016]进一步，所述试剂盒还包括聚合酶、反应缓冲液、SYBR荧光染料和水。所述聚合酶为Taq DNA聚合酶；所述水为ddH2O。所述聚合酶、所述反应缓冲液、所述SYBR荧光染料共同组成SYBR Green Premix Pro Taq。
[0017]进一步，所述检测体系总体积20.0μL，具体为：10.0μL的SYBR Green Premix Pro Taq，0.5μL的CIAV
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124
‑
F，0.5μL的CIAV
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124
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R，1.0μL的检测模板以及8.0μL的ddH2O。反应程序为：95℃维持2min；95℃维持30s，62℃维持20s，72℃维持30s，重复40个循环。
[0018]进一步，所述荧光定量PCR试剂盒还包括阳性标准质粒。
[0019]进一步，所述阳性标准质粒的制备方法包括步骤：
[0020](1)获取如SEQ ID NO.3所示的目的片段；
[0021](2)将所述目的片段与克隆载体连接，获得重组质粒；
[0022](3)重组质粒经验证后即为阳性标准质粒。
[0023]所述荧光定量PCR试剂盒的标准曲线方程为：
[0024]Y＝
‑
3.2514X+37.091；
[0025]相关系数R2＝0.9995；
[0026]扩增效率E＝103.03％；
[0027]X轴为阳性标准质粒的拷贝数；Y轴为循环阈值。不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系，符合预期结果。
[0028]本专利技术包括以下有益效果：
[0029]本专利技术提供针对CIAV的VP1基因中高保守性的基因片段能够特异性扩增的引物对，有效提高使用分子生物学检测CIAV的抗干扰能力。经试验证实所述荧光定量P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组引物对，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物CIAV
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124
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F和如SEQ ID NO.2所示下游引物CIAV
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R。2.一种检测鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括聚合酶、反应缓冲液、SYBR荧光染料和水。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述聚合酶为Taq DNA聚合酶。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述水为ddH2O。6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄淑坚，姜含雨，梅堃，曾繁聪，柯骏鸿，罗瑞，李文俊，姜雪芹，黄惠兰，
申请(专利权)人：佛山科学技术学院，
类型：发明
国别省市：