编辑核苷酸序列的方法和组合物技术

本公开提供了用于对靶DNA分子(如，基因组)进行引导编辑的组合物和方法，所述引导编辑使得能够掺入核苷酸变化和/或靶向诱变。核苷酸变化可包括单核苷酸变化(如，任何转换或任何颠换)、一个或多个核苷酸插入或者一个或多个核苷酸缺失。更具体地，本公开提供了包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)和聚合酶(如，逆转录酶)的融合蛋白，其由经修饰的向导RNA(被称为PEgRNA)引导至特定DNA序列。PEgRNA(相对于标准向导RNA)已改变为包含延伸部分，该延伸部分提供编码单链DNA瓣的DNA合成模板序列，其与待编辑的靶向内源性DNA序列的链同源但包含期望的一个或多个核苷酸变化，并且在被聚合酶(如，逆转录酶)合成之后掺入靶DNA分子中。本文还公开了利用引导编辑的各种方法，包括治疗三核苷酸重复缩减疾病、安装靶向肽标签、通过安装保护突变来治疗朊病毒病、操纵RNA编码基因以安装用于控制RNA功能和表达的RNA标签，使用引导编辑构建复杂的基因文库，使用引导编辑将免疫表位插入蛋白，使用引导编辑将可诱导的二聚化结构域插入蛋白靶标，以及递送方法等。方法等。方法等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编辑核苷酸序列的方法和组合物
[0001]政府支持
[0002]本专利技术是在获得美国国家卫生研究院授予的资助号U01AI142756、RM1HG009490、R01EB022376和R35GM118062的政府支持下进行的。政府对本专利技术享有一定的权利。
[0003]相关申请和引用并入
[0004]本美国临时申请涉及并通过引用并入以下申请，即，2019年3月19日提交的美国临时申请号62/820,813(代理人案卷号B1195.70074US00)、2019年6月7日提交的美国临时申请号62/858,958(代理人案卷号B1195.70074US01)，2019年8月21日提交的美国临时申请号62/889,996(代理人案卷号B1195.70074US02)，2019年8月21日提交的美国临时申请号62/922,654(代理人案卷编号B1195.70083US00)，美国临时申请号62/889,996，2019年10月10日提交的美国临时申请号62/913,553(代理人案卷编号B1195.70074US03)，2019年10月10日提交的美国临时申请号62/973,558(代理人案卷编号B1195.70083US01)，2019年11月5日提交的美国临时申请号62/931,195(代理人案卷号B1195.70074US04)，2019年12月5日提交的美国临时申请号62/944,231(代理人案卷号B1195.70074US05),2019年12月5日提交的美国临时申请号62/974,537(代理人案卷号B1195.70083US02),2020年3月17日提交的美国临时申请号62/991,069(代理人案卷号B1195.70074US06),以及2020年3月17日提交的美国临时申请号(在提交本申请时未获得系列号)(代理人案卷号B1195.70083US03)。
[0005]专利技术背景
[0006]据某些估计，致病性单核苷酸突变导致约50％的有遗传组分的人类疾病7。不幸地，尽管进行了数十年的基因治疗探索，但这些遗传性疾病患者的治疗选择仍然非常有限8。也许应对这一治疗挑战的最节俭的解决方案是直接校正患者基因组中的单核苷酸突变，这将解决疾病的根本原因并可能提供持久的益处。尽管这种策略以前是不可想象的，但最近CRISPR/Cas系统9的出现带来的基因组编辑能力的改进现在已经使这种治疗方法触手可及。通过直接设计包含与靶DNA序列互补的约20个核苷酸的向导RNA(guide RNA,gRNA)序列，CRISPR相关(Cas)核酸酶可特异性接近几乎任何可想到的基因组位点
1,2
。迄今为止，已鉴定了几种单体细菌Cas核酸酶系统并调整用于基因组编辑应用
10
。Cas核酸酶的这种天然多样性，以及越来越多的工程化变体
11
‑
14
，为开发新的基因组编辑技术提供了肥沃的土壤。
[0007]虽然利用CRISPR进行基因破坏目前是成熟的技术，但精确编辑人类基因组中的单碱基对仍然是主要挑战3。同源定向修复(HDR)长期以来一直用于在人类细胞和其他生物体中使用编码期望编辑的供体DNA修复模板在双链断裂(DSB)位置插入、校正或交换DNA序列。然而，传统HDR在大多数人类细胞类型中的效率非常低，尤其是在非分裂细胞中，并且竞争性非同源末端连接(NHEJ)主要导致插入
‑
缺失(indel)副产物
16
。其他问题与DSB的产生有关，这会导致靶基因座处大的染色体重排和缺失
17
，或激活p53轴，导致生长停滞和凋亡
18,19
。
[0008]已经探索了几种方法来解决HDR的这些缺点。例如，已证明利用寡核苷酸供体修复单链DNA断裂(缺口)减少插入/缺失形成，但期望的修复产物的产率仍然很低
20
。其他策略尝试使用小分子和生物试剂将修复偏向于HDR而非NHEJ
21
‑
23
。然而，这些方法的有效性可能取
决于细胞类型，并且扰动正常细胞状态会导致不期望且不可预见的影响。
[0009]最近，由David Liu教授等领导的专利技术人开发了碱基编辑作为编辑靶核苷酸而不形成DSB或依赖于HDR的技术4‑
6,24
‑
27
。通过Cas融合脱氨酶直接修饰DNA碱基可在短的靶窗口(约5
‑
7个碱基)内以非常高的效率将C
·
G转换为T
·
A，或A
·
T转换为G
·
C。因此，碱基编辑器(editor)已迅速被科学界采用。然而，以下因素限制了它们在精确基因组编辑中的普遍性：(1)观测到靶窗口内的非靶C或A碱基的“旁观者编辑”；(2)观测到靶核苷酸产物混合物；(3)靶碱基必须位于PAM序列上游15
±
2个核苷酸处；以及(5)小的插入和缺失突变的修复是不可能的。
[0010]因此，开发能够灵活地引入任何期望的单核苷酸变化和/或能够安装(install)碱基对插入或缺失(如，至少1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个碱基对插入或缺失)和/或能够以高特异性和高效率改变或修饰靶位点处的核苷酸序列将大大扩展基于CRISPR的基因组编辑技术的范围和治疗潜力。
[0011]专利技术概述
[0012]本专利技术描述了被称为“引导编辑(prime editing)”的全新基因组编辑平台。引导编辑是通用且精确的基因组编辑方法，其使用与聚合酶联合作用的核酸可编程DNA结合蛋白(“napDNAbp”)(即，以融合蛋白的形式或在其它情况下与napDNAbp以反式提供)直接将新的遗传信息写入指定的DNA位点，其中引导编辑系统利用引导编辑(PE)向导RNA(“PEgRNA”)编程，该PEgRNA既指定靶位点，又以通过延伸(DNA或RNA)工程化至向导RNA(如，在向导RNA的5
′
或3
′
端处或内部部分中)的置换DNA链的形式为期望编辑的合成提供模板。含有期望编辑(如，单核碱基取代)的置换链与待编辑的靶位点的内源性链共有相同的序列(除了它包括期望编辑)。通过DNA修复和/或复制机制，靶位点的内源性链被新合成的包含期望编辑的置换链替换。在某些情况下，可认为引导编辑是“搜索和置换”基因组编辑技术，因为本文所述引导编辑不仅搜索和定位待编辑的期望的靶位点，而且同时编码含有期望编辑的置换链，其得到安装代替相应靶位点内源性DNA链。
[0013]本公开的引导编辑器部分地涉及以下发现：可利用或调整靶标引发(target
‑
primed)的逆转录(TPRT)或“引导编辑”的机制进行基于CRISPR/Cas的精确基因组编辑，具有高效率和遗传可塑性(如，如图1A至1F的不同实施方案所描绘)。可移动的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于引导编辑(prime editing)的复合物，其包含：(i)融合蛋白，所述融合蛋白包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)和包含RNA依赖性DNA聚合酶活性的结构域；和(ii)引导编辑向导RNA(PEgRNA)。2.如权利要求1所述的复合物，其中所述融合蛋白能够在所述引导编辑向导RNA(PEgRNA)存在下进行引导编辑以在靶序列中安装期望的核苷酸变化。3.如权利要求11所述的复合物，其中所述napDNAbp具有切口酶活性。4.如权利要求1所述的复合物，其中所述napDNAbp是Cas9蛋白或其变体。5.如权利要求1所述的复合物，其中所述napDNAbp是核酸酶活性Cas9、无核酸酶活性Cas9(dCas9)、或Cas9切口酶(nCas9)。6.如权利要求1所述的复合物，其中所述napDNAbp是Cas9切口酶(nCas9)。7.如权利要求1所述的复合物，其中所述napDNAbp选自下组：Cas9、Cas12e、Cas12d、Cas12a、Cas12b1、Cas13a、Cas12c和Argonaute蛋白，并且任选地具有切口酶活性。8.如权利要求1所述的复合物，其中所述包含RNA依赖性DNA聚合酶活性的结构域是逆转录酶，所述逆转录酶包含SEQ ID NO:89
‑
100、105
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122、128
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129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701
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716、739
‑
741和766中的任一氨基酸序列。9.如权利要求1所述的复合物，其中所述包含RNA依赖性DNA聚合酶活性的结构域是逆转录酶，所述逆转录酶包含与SEQ ID NO:89
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100、105
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122、128
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129、132、139、143、149、154、159、235、454、471、516、662、700、701
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716、739
‑
741和766中的任一氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。10.如权利要求1所述的复合物，其中所述包含RNA依赖性DNA聚合酶活性的结构域是来自逆转录病毒或逆转录转座子的天然存在的逆转录酶。11.如权利要求1所述的复合物，其中所述融合蛋白与PEgRNA复合时能够结合靶DNA序列。12.如权利要求1所述的复合物，其中所述PEgRNA包含向导RNA和包含DNA合成模板的至少一个核酸延伸臂。13.如权利要求12所述的复合物，其中所述核酸延伸臂位于所述向导RNA的3'或5'末端处、或所述向导RNA中的分子内位置处，并且其中所述核酸延伸臂是DNA或RNA。14.如权利要求12所述的复合物，其中所述PEgRNA能够结合napDNAbp并将所述napDNAbp引导至靶DNA序列。15.如权利要求14所述的复合物，其中所述靶DNA序列包含靶链和互补的非靶链。16.如权利要求12所述的复合物，其中所述向导RNA与所述靶链杂交形成RNA
‑
DNA杂合体和R
‑
环。17.如权利要求12所述的复合物，其中所述至少一个核酸延伸臂还包含引物结合位点。18.如权利要求12所述的复合物，其中所述核酸延伸臂为至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸、至少22个核苷酸、至少23个核苷酸、至少24个核苷酸、至少25个核苷酸、至少26个核苷酸、至少27个
核苷酸、至少28个核苷酸、至少29个核苷酸、至少30个核苷酸、至少31个核苷酸、至少32个核苷酸、至少33个核苷酸、至少34个核苷酸、至少35个核苷酸、至少36个核苷酸、至少37个核苷酸、至少38个核苷酸、至少39个核苷酸、至少40个核苷酸、至少41个核苷酸、至少42个核苷酸、至少43个核苷酸、至少44个核苷酸、至少45个核苷酸、至少46个核苷酸、至少47个核苷酸、至少48个核苷酸、至少49个核苷酸、或至少50个核苷酸。19.如权利要求12所述的复合物，其中所述DNA合成模板的长度为至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、或至少15个核苷酸。20.如权利要求17所述的复合物，其中所述引物结合位点的长度为至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸、至少10个核苷酸、至少11个核苷酸、至少12个核苷酸、至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、或至少15个核苷酸。21.如权利要求12所述的复合物，其中所述PEgRNA还包含至少一个选自下组的另外的结构：接头、茎环、发夹、趾环(toeloop)、适体或RNA
‑
蛋白募集结构域。22.如权利要求12所述的复合物，其中所述DNA合成模板编码与邻近切口位点的内源性DNA序列互补的单链DNA瓣(flap)，其中所述单链DNA瓣包含期望的核苷酸变化。23.如权利要求22所述的复合物，其中所述单链DNA瓣置换已产生切口的靶DNA序列中具有5'末端的内源性单链DNA，并且其中所述内源性单链DNA在所述切口位点的紧邻下游。24.如权利要求23所述的复合物，其中细胞切除所述具有游离5'末端的内源性单链DNA。25.如权利要求23所述的复合物，其中所述单链DNA瓣的细胞修复导致安装所述期望的核苷酸变化，从而形成期望的产物。26.如权利要求12所述的复合物，其中所述PEgRNA包含SEQ ID NO:18
‑
36的核苷酸序列，或与SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：DR刘，AV安扎隆，P伦道夫，J尼尔森，
申请(专利权)人：哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：