一组应用于不同高通量测序平台文库的通用环化陪伴序列、其试剂盒以及环化方法技术

本发明专利技术提供了一组针对不同高通量测序平台文库的通用环化陪伴序列、其试剂盒以及环化方法，包括：在连接缓冲液(splint buffer)中添加三组针对华大单端、双端标签文库，以及Illumina文库接头互补部分的陪伴序列(splint oligo)片段，可同时对不同类型文库进行单链DNA的环化；并且在通用环化连接缓冲液体系中添加促进剂提高环化效率。本发明专利技术便捷灵活、兼容性强，解决了对于不同类型文库需要使用与之对应的环化试剂的问题。对应的环化试剂的问题。对应的环化试剂的问题。

【技术实现步骤摘要】
一组应用于不同高通量测序平台文库的通用环化陪伴序列、其试剂盒以及环化方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及二代测序技术。更具体地，涉及一组同时针对不同高通量测序平台文库环化的通用环化陪伴序列、方法及其试剂盒。

技术介绍

[0002]高通量测序技术(High
‑
throughput sequencing)又称为下一代测序技术(Next
‑
generation sequencing technology)，可以一次测定几十万到几百万条DNA分子，并且获得高通量的数据。主要有三个基本步骤：文库制备、测序和数据分析。文库制备不但是实现测序平台的第一步，也是关键一步，影响着后续读取序列的稳定性和准确性。
[0003]基因测序相关技术持续革新，行业竞争格局也在不断扩大，在众多第二代测序平台中，对于跨平台文库制备需求增加，例如以华大智造测序仪使用华大单端、双端标签文库与Illumina文库。华大测序仪可以稳定产出高质量测序数据，相对于Illumina平台其测序重复(duplicates)更低，标签跳跃(index hopping)问题也得到了显著解决，然而若要使用跨平台文库则需要先解决DNA环化的问题。
[0004]华大智造BGISEQ测序平台使用了DNBSEQ技术，该技术的关键是透过陪伴序列(splint oligo)所形成的单链环状DNA分子再进行链置换的滚环扩增，其后制成DNA纳米球(DNA nanoball,DNB)并进行测序。该方法每个扩增循环都以原始的单链环状DNA文库为模板，保持每个拷贝的独立性，可提高测序的准确性，避免扩增错误的累积。
[0005]虽然华大智造推出的MGIEasy通用文库转换试剂盒(App
‑
A)可以实现将线性DNA文库(例如Illumina平台文库)转换成兼容华大智造测序平台矩阵式纳米芯片的单链环状DNA文库；然而，相较原先华大智造MGI的测序流程，还需要利用AC
‑
PCR引子(Primer)将Illumina文库转化为可进行环化的5
’
磷酸化的双链DNA文库，且后续单链DNA环化、DNA纳米球制备与测序时均需要对部分试剂进行替换。
[0006]这于文库制备上造成诸多不便，例如：(1)需要事先规划选择使用何种平台文库；(2)需要配置针对不同平台文库的实验试剂；(3)若想要达到跨平台，DNA环化效率有不足以形成下游华大测序DNA纳米球的疑虑。
[0007]目前DNA文库环化均需使用与之匹配的环化试剂盒，市面上更未有一款针对不同高通量测序平台文库的通用环化试剂盒，并且欲达到跨平台制备文库，单链DNA环化效率仍需进一步的提升和改进。

技术实现思路

[0008]本专利技术旨在提供一组能够同时针对不同高通量测序平台文库的通用环化陪伴序列，以解决现有技术中对不同类型文库不能使用同一试剂完成环化的问题。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]本专利技术提供一组应用于不同高通量测序平台文库进行环化的通用陪伴序列，其特
征在于，所述平台包括Illumina平台和MGI平台，所述陪伴序列包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的一组或多组。
[0011]在一实施方案中，本专利技术提供一种应用于不同高通量测序平台文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括连接缓冲液和上述一组或多组陪伴序列。
[0012]优选地，本专利技术提供的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括促进剂。
[0013]优选地，本专利技术提供的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括连接酶。
[0014]更优选地，本专利技术提供的试剂盒，其特征在于，所述促进剂选自PEG 6000和/或单链结合蛋白。
[0015]在一实施方案中，本专利技术提供的一种通用环化连接缓冲液体系，该体系以19.5μL为总反应体积，其中包含2
‑
8μL促进剂PEG 6000(2μL、4μL、6μL、8μL)和/或1
‑
4μL单链结合蛋白(1μL、2μL、3μL、4μL)。
[0016]优选地，在通用环化连接缓冲液体系，该体系以19.5μL为总反应体积，其中包含2μL的PEG 6000和/或2μL单链结合蛋白。
[0017]在一实施方案中，本专利技术提供一种同时针对不同高通量测序平台文库的通用环化方法，其特征在于，所述平台文库包括Illumina平台和MGI平台，所述方法包括以下步骤：
[0018](1)将上述一组或多组的陪伴序列、连接缓冲液与片段化DNA混合，并透过连接酶进行连接，得到带陪伴序列的DNA环化中间产物；
[0019](2)将所述带陪伴序列的DNA环化中间产物进行PCR扩增，得到环化产物。
[0020]优选地，其特征在于，在将所述陪伴序列与片段化DNA进行连接之前，对片段化DNA进行退火的步骤。
[0021]优选地，其特征在于，使用上述任一项试剂盒的组合进行环化。
[0022]更优选地，退火步骤为PCR仪设定温度95℃、3分钟的程序。
[0023]更优选地，上述步骤(2)经PCR扩增后，70μL环化产物与2μL消化酶(Digestion Enzyme)进行反应。
[0024]更优选地，上述环化产物经酶切消化后，加入7μL反应终止液。
[0025]更优选地，使用磁珠与乙醇纯化环化产物。
[0026]需要说明的是，本专利技术的试剂按照上述定义，并不意味着本专利技术的试剂局限用于稀释成特定体积，而是根据上述定义来确定本专利技术的试剂中各种组分的比例关系和浓度。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0028](1)适用于不同高通量测序平台的通用环化陪伴序列，不需要针对特定平台挑选对应的陪伴序列。
[0029](2)使用的一种环化试剂盒可以同时对不同类型的文库进行环化，且不需要依照特定平台替换相应试剂。
[0030](3)试剂盒中可包含促进剂，该促进剂可以提高环化效率。
[0031](4)简化同时进行多类型文库环化实验的程序。
[0032](5)各种类型文库制备产出的单链环状DNA，可以作为下游华大测序DNA纳米球形成的原料。
附图说明
[0033]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成本专利技术的不当限定。在附图中：
[0034]图1是表示单链环状DNA的制备原理流程图。
[0035]图2为陪伴序列与三种文库联合使用的环化结果。
[0036]图3为促进剂PEG 6000的环化测试结果。图3A表示不同添加量的40％浓度PEG 6000的环化效率；图3B显示PEG 6000添加量对插入片段大小(insert size)的影响。其中，MGI为对照组，是华大智造公司MGIEasy环化模块V2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组应用于不同高通量测序平台文库进行环化的通用陪伴序列，其特征在于，所述平台包括Illumina平台和MGI平台，所述陪伴序列包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的一组或多组。2.一种应用于不同高通量测序平台文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括连接缓冲液和权利要求1所述的陪伴序列。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括促进剂。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括连接酶。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述促进剂选自PEG6000和/或单链结合蛋白。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：章明晔，胡玉刚，吴强，
申请(专利权)人：纳昂达南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：