用于纳米孔测序的DirectRNA混Barcode文库构建方法技术

本发明专利技术提供一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法，包括：合成独特的RNA Barcode RTA接头，连接接头后将mRNA反转录为cDNA，混样后连接ONT测序接头。该方法可以实现多样本混池Direct RNA测序，直接对原始RNA分子进行测序，可以克服RT和PCR bias。Direct RNA

【技术实现步骤摘要】
用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学和三代RNA测序
，具体地说，涉及一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法。

技术介绍

[0002]超过90％的人类基因存在可变剪接，它们会形成两个或更多的表达异构体。在短读长cDNA测序中有很大比例的读长定位模糊，这种局限在正确识别和定量基因的多种异构体表达上尤为明显。长读长cDNA测序方法能够产生跨越整个异构体的全长转录本序列，从而去除或大幅度减少模糊定位，并改进差异异构表达的分析结果。然而，以上方法依赖于cDNA的合成及PCR扩增，去除了天然RNA的碱基修饰信息，并且只能粗略地估计多聚腺苷酸poly(A)尾长。
[0003]N6
‑
甲基腺苷(m6A)是信使RNA和环状RNA中的一种普遍修饰，在调节RNA代谢的各个方面起着重要作用。一种广泛使用的鉴定m6A修饰的方法依赖于m6A特异性抗体，然后进行沉淀RNA测序(MeRIP
‑
Seq)。然而，MeRIP
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Seq的一个局限性在于它无法以单核苷酸分辨率提供m6A的精确位置。
[0004]ONT直接RNA测序技术是对天然RNA进行测序，能够保留并检测RNA碱基修饰信息，对poly(A)尾长进行相对准确的估算，同时进行全长异构体分析，还原真实RNA特征。通过使用ONT平台直接对native RNA分子进行测序，还可以克服RT和PCR bias。Direct RNAr/>‑
seq可以产生较长的reads，通常覆盖转录本的全长。该方法可以准确地量化转录本，以动态范围分析差异基因表达，同时可以准确鉴定转录本的结构和边界，包括剪接产物。最重要的是可以以单碱基分辨率鉴定RNA修饰的类型。
[0005]目前ONT官方(Oxford Nanopore Technologies)提供的Direct RNA
‑
seq试剂盒，只能满足单一样本的上机要求，高成本严重影响了该技术的适用性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供用于纳米孔直接RNA测序的逆转录接头(RNA Barcode RTA接头)，由SEQ ID NO:1和2所示的两条单链RNA引物退火而成。
[0008]优选地，两条单链RNA引物的5'端经磷酸化修饰，即两条单链RNA引物的5'端修饰有PHO。
[0009]本专利技术的逆转录接头适用于所有带A尾的RNA的逆转录。
[0010]第二方面，本专利技术提供含有所述逆转录接头或所述单链RNA引物的试剂盒。
[0011]第三方面，本专利技术提供一种用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法，包括以下步骤：
[0012]1)合成所述逆转录接头；
[0013]2)样品总RNA的提取以及mRNA的制备；
[0014]3)将mRNA与逆转录接头连接后进行反转录合成cDNA；
[0015]4)将步骤3)所得的反转录产物(RNA
‑
DNA杂合双链)连接RNA直测接头后，作为直接RNA测序文库，进行纳米孔测序(Direct RNA测序)。
[0016]步骤4)中所述的RNA直测接头的序列如下：
[0017]采用ONT平台RNA直接测序RMX接头：
[0018]Top：5'
‑
TGATGATGAGGGATAGACGATGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTTTTTTTTTTATGATGCAAGATACGCAC
‑
3'
[0019]Bottom：5'
‑
GAGGCGAGCGGTCAATTTGCAATATCAGCACCAACAGAAACAACCATCGTCTATCCCTCATCATCAGAACCTACTA
‑
3'
[0020]优选地，步骤1)中将两条单链RNA按等摩尔比混合后，于90
‑
95℃(优选95℃)保温2min，然后以0.1
‑
1℃/s(优选0.1℃/s)的速度梯度退火至20
‑
30℃(优选25℃)。
[0021]步骤3)中连接的反应体系如下：mRNA 16.5μl，连接反应缓冲液4.8μl，40U/ml RNase抑制剂0.5
‑
1μl(优选0.5μl)，1.4μM逆转录接头0.5
‑
1μl(优选0.7μl)，400U/μl T4 DNA连接酶1
‑
2μl(优选1.5μl)，总体系24μl；
[0022]反应条件为：室温反应30min，得到连接产物。
[0023]步骤3)中反转录的反应体系为：连接产物24μl，10mM dNTPs 2.0μl，5
×
第一链缓冲液8.0μl，0.1M DTT 4.0μl，反转录酶2μl；
[0024]反应条件为：50℃60min，70℃10min，4℃保存，得到反转录产物。
[0025]步骤4)中连接的反应体系如下：反转录产物24.3μl，连接反应缓冲液4.8μl，1.4μM RNA直测接头4.2μl，40U/ml RNase抑制剂0.5
‑
1μl(优选0.5μl)，400U/μl T4 DNA连接酶1
‑
3.0μl(优选3.0μl)，总体系40μl；
[0026]反应条件为：室温反应30min，得到连接产物。
[0027]进一步地，步骤3)～4)之间还包括对反转录产物进行磁珠纯化的步骤。
[0028]进一步地，步骤4)中进行纳米孔测序之前还包括对连接产物进行磁珠纯化的步骤。
[0029]本专利技术方法适用于包括5mC和6mA修饰的所有RNA测序文库的构建。
[0030]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0031](一)该方法可以实现多样本混池Direct RNA测序，直接对原始RNA分子进行测序，可以克服RT和PCR bias。Direct RNA
‑
seq还可以产生较长的reads，通常覆盖转录本的全长。该方法可以准确地量化转录本，以动态范围分析差异基因表达，同时可以准确鉴定转录本的结构和边界，包括剪接产物，最重要的是可以以单碱基分辨率鉴定RNA修饰的类型。
[0032](二)模板起始量低：7μg总RNA即可作为起始模板，进行Direct RNA测序。
[0033](三)定量准确：作为长读长测序技术，能减少短读长测序打断后重新拼接带来的歧义，结果准确度更高、更可信；直接对RNA进行测序，避免逆转录和PCR扩增导致的RNA修饰信息缺失。
[0034](四)直接检测RNA修饰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于纳米孔直接RNA测序的逆转录接头，其特征在于，由SEQ ID NO:1和2所示的两条单链RNA引物退火而成。2.根据权利要求1所述的逆转录接头，其特征在于，两条单链RNA引物的5'端经磷酸化修饰。3.含有权利要求1或2所述逆转录接头的试剂盒。4.用于纳米孔测序的Direct RNA混Barcode文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)合成权利要求1所述的逆转录接头；2)样品总RNA的提取以及mRNA的制备；3)将mRNA与逆转录接头连接后进行反转录合成cDNA；4)将步骤3)所得的反转录产物连接RNA直测接头后，作为直接RNA测序文库，进行纳米孔测序；其中，步骤4)中所述的RNA直测接头的序列如下：Top：5'
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TGATGATGAGGGATAGACGATGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTTTTTTTTTTATGATGCAAGATACGCAC
‑
3'Bottom：5'
‑
GAGGCGAGCGGTCAATTTGCAATATCAGCACCAACAGAAACAACCATCGTCTATCCCTCATCATCAGAACCTACTA
‑
3'。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中将两条单链RNA按等摩尔比混合后，于90
‑
95℃保温2min，然后以0.1
‑
1℃/s的速度梯度退火至20
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，刘敏，张梦龙，
申请(专利权)人：北京百迈客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：