编辑核苷酸序列的方法和组合物技术

本公开提供了用于对靶DNA分子(如，基因组)进行引导编辑的组合物和方法，所述引导编辑使得能够掺入核苷酸变化和/或靶向诱变。核苷酸变化可包括单核苷酸变化(如，任何转换或任何颠换)、一个或多个核苷酸插入或者一个或多个核苷酸缺失。更具体地，本公开提供了包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)和聚合酶(如，逆转录酶)的融合蛋白，其由经修饰的向导RNA(被称为PEgRNA)引导至特定DNA序列。PEgRNA(相对于标准向导RNA)已改变为包含延伸部分，该延伸部分提供编码单链DNA瓣的DNA合成模板序列，其与待编辑的靶向内源性DNA序列的链同源但包含期望的一个或多个核苷酸变化，并且在被聚合酶(如，逆转录酶)合成之后掺入靶DNA分子中。本文还公开了利用引导编辑的各种方法，包括治疗三核苷酸重复缩减疾病、安装靶向肽标签、通过安装保护突变来治疗朊病毒病、操纵RNA编码基因以安装用于控制RNA功能和表达的RNA标签，使用引导编辑构建复杂的基因文库，使用引导编辑将免疫表位插入蛋白，使用引导编辑将可诱导的二聚化结构域插入蛋白靶标，以及递送方法等。方法等。方法等。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编辑核苷酸序列的方法和组合物
[0001]政府支持
[0002]本专利技术是在获得美国国家卫生研究院授予的资助号U01AI142756、RM1HG009490、R01EB022376和R35GM118062的政府支持下进行的。政府对本专利技术享有一定的权利。
[0003]相关申请和引用并入
[0004]本美国临时申请涉及并通过引用并入以下申请，即，2019年3月19日提交的美国临时申请号62/820,813(代理人案卷号B1195.70074US00)、2019年6月7日提交的美国临时申请号62/858,958(代理人案卷号B1195.70074US01)，2019年8月21日提交的美国临时申请号62/889,996(代理人案卷号B1195.70074US02)，2019年8月21日提交的美国临时申请号62/922,654(代理人案卷编号B1195.70083US00)，美国临时申请号62/889,996，2019年10月10日提交的美国临时申请号62/913,553(代理人案卷编号B1195.70074US03)，2019年10月10日提交的美国临时申请号62/973,558(代理人案卷编号B1195.70083US01)，2019年11月5日提交的美国临时申请号62/931,195(代理人案卷号B1195.70074US04)，2019年12月5日提交的美国临时申请号62/944,231(代理人案卷号B1195.70074US05),2019年12月5日提交的美国临时申请号62/974,537(代理人案卷号B1195.70083US02),2020年3月17日提交的美国临时申请号62/991,069(代理人案卷号B1195.70074US06),以及2020年3月17日提交的美国临时申请号(在提交本申请时未获得系列号)(代理人案卷号B1195.70083US03)。
[0005]专利技术背景
[0006]据某些估计，致病性单核苷酸突变导致约50％的有遗传组分的人类疾病7。不幸地，尽管进行了数十年的基因治疗探索，但这些遗传性疾病患者的治疗选择仍然非常有限8。也许应对这一治疗挑战的最节俭的解决方案是直接校正患者基因组中的单核苷酸突变，这将解决疾病的根本原因并可能提供持久的益处。尽管这种策略以前是不可想象的，但最近CRISPR/Cas系统9的出现带来的基因组编辑能力的改进现在已经使这种治疗方法触手可及。通过直接设计包含与靶DNA序列互补的约20个核苷酸的向导RNA(guide RNA,gRNA)序列，CRISPR相关(Cas)核酸酶可特异性接近几乎任何可想到的基因组位点
1,2
。迄今为止，已鉴定了几种单体细菌Cas核酸酶系统并调整用于基因组编辑应用
10
。Cas核酸酶的这种天然多样性，以及越来越多的工程化变体
11
‑
14
，为开发新的基因组编辑技术提供了肥沃的土壤。
[0007]虽然利用CRISPR进行基因破坏目前是成熟的技术，但精确编辑人类基因组中的单碱基对仍然是主要挑战3。同源定向修复(HDR)长期以来一直用于在人类细胞和其他生物体中使用编码期望编辑的供体DNA修复模板在双链断裂(DSB)位置插入、校正或交换DNA序列。然而，传统HDR在大多数人类细胞类型中的效率非常低，尤其是在非分裂细胞中，并且竞争性非同源末端连接(NHEJ)主要导致插入
‑
缺失(indel)副产物
16
。其他问题与DSB的产生有关，这会导致靶基因座处大的染色体重排和缺失
17
，或激活p53轴，导致生长停滞和凋亡
18,19
。
[0008]已经探索了几种方法来解决HDR的这些缺点。例如，已证明利用寡核苷酸供体修复单链DNA断裂(缺口)减少插入/缺失形成，但期望的修复产物的产率仍然很低
20
。其他策略尝试使用小分子和生物试剂将修复偏向于HDR而非NHEJ
21
‑
23
。然而，这些方法的有效性可能取
决于细胞类型，并且扰动正常细胞状态会导致不期望且不可预见的影响。
[0009]最近，由David Liu教授等领导的专利技术人开发了碱基编辑作为编辑靶核苷酸而不形成DSB或依赖于HDR的技术4‑
6,24
‑
27
。通过Cas融合脱氨酶直接修饰DNA碱基可在短的靶窗口(约5
‑
7个碱基)内以非常高的效率将C
·
G转换为T
·
A，或A
·
T转换为G
·
C。因此，碱基编辑器(editor)已迅速被科学界采用。然而，以下因素限制了它们在精确基因组编辑中的普遍性：(1)观测到靶窗口内的非靶C或A碱基的“旁观者编辑”；(2)观测到靶核苷酸产物混合物；(3)靶碱基必须位于PAM序列上游15
±
2个核苷酸处；以及(5)小的插入和缺失突变的修复是不可能的。
[0010]因此，开发能够灵活地引入任何期望的单核苷酸变化和/或能够安装(install)碱基对插入或缺失(如，至少1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个碱基对插入或缺失)和/或能够以高特异性和高效率改变或修饰靶位点处的核苷酸序列将大大扩展基于CRISPR的基因组编辑技术的范围和治疗潜力。
[0011]专利技术概述
[0012]本专利技术描述了被称为“引导编辑(prime editing)”的全新基因组编辑平台。引导编辑是通用且精确的基因组编辑方法，其使用与聚合酶联合作用的核酸可编程DNA结合蛋白(“napDNAbp”)(即，以融合蛋白的形式或在其它情况下与napDNAbp以反式提供)直接将新的遗传信息写入指定的DNA位点，其中引导编辑系统利用引导编辑(PE)向导RNA(“PEgRNA”)编程，该PEgRNA既指定靶位点，又以通过延伸(DNA或RNA)工程化至向导RNA(如，在向导RNA的5
′
或3
′
端处或内部部分中)的置换DNA链的形式为期望编辑的合成提供模板。含有期望编辑(如，单核碱基取代)的置换链与待编辑的靶位点的内源性链共有相同的序列(除了它包括期望编辑)。通过DNA修复和/或复制机制，靶位点的内源性链被新合成的包含期望编辑的置换链替换。在某些情况下，可认为引导编辑是“搜索和置换”基因组编辑技术，因为本文所述引导编辑不仅搜索和定位待编辑的期望的靶位点，而且同时编码含有期望编辑的置换链，其得到安装代替相应靶位点内源性DNA链。
[0013]本公开的引导编辑器部分地涉及以下发现：可利用或调整靶标引发(target
‑
primed)的逆转录(TPRT)或“引导编辑”的机制进行基于CRISPR/Cas的精确基因组编辑，具有高效率和遗传可塑性(如，如图1A至1F的不同实施方案所描绘)。可移动的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.通过引导编辑在由靶核苷酸序列编码的感兴趣的RNA中安装核糖核苷酸基序或标签的方法，所述方法包括：(a)使所述靶核苷酸序列与以下接触：(i)包含核酸可编程DNA结合蛋白(napDNAbp)和聚合酶的引导编辑器，和(ii)包含编码所述核糖核苷酸基序或标签的编辑模板的PEgRNA；从而使编码所述核糖核苷酸基序或标签的单链DNA序列聚合；以及通过DNA修复和/或复制过程在所述靶核苷酸序列处掺入所述单链DNA序列以代替相应的内源性链，其中所述方法产生包含所述核糖核苷酸基序或标签的编码经修饰的感兴趣的RNA的靶核苷酸序列。2.权利要求1的方法，其中核糖核苷酸基序或标签为检测部分。3.权利要求1的方法，其中所述核糖核苷酸基序或标签影响所述感兴趣的RNA的表达水平。4.权利要求1的方法，其中所述核糖核苷酸基序或标签影响所述感兴趣的RNA的转运或亚细胞定位。5.权利要求1的方法，其中所述核糖核苷酸基序或标签选自下组：SV401型、SV40 2型、SV40 3型、hGH、BGH、rbGlob、TK、MALAT1 ENE
‑
mascRNA、KSHV PAN ENE、Smbox/U1 snRNA框、U1 snRNA 3'框、tRNA<...

【专利技术属性】
技术研发人员：DR刘，AV安扎隆，
申请(专利权)人：哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：