使用增强的靶向编辑技术的定向基因组工程制造技术

本公开提供用于增强靶向基因组编辑和工程化的方法和组合物。程化的方法和组合物。程化的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用增强的靶向编辑技术的定向基因组工程
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年5月29日提交的美国临时专利申请号62/854,146的权益，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
[0003]序列表的并入
[0004]包含在名为“P34496WO00_SL.txt”的文件中的序列表为160,654字节(在MS
‑
中测量)并于2020年5月28日创建，随此以电子方式提交并以引用的方式整体并入。

技术介绍

[0005]经典的植物或动物育种依赖于染色体重组来发展或引入期望的性状。然而，此类重组的位置在很大程度上仍然是不可预测和不可控制的。所期望的染色体重组事件也以相当低的频率发生。不可预测性和低频率对靶向基因组工程提出了挑战，尤其是在全基因组或染色体水平(例如，染色体臂的交换和基因组区段的易位)。需要开发新技术来促进和提高靶向基因组工程的效率。本申请提供了满足这种需要的各种途径(包括组合物和方法)。

技术实现思路

[0006]在一个方面，本申请提供了一种基因组编辑系统，其包括：a)核酸酶或编码所述核酸酶的第一核酸；b)DNA靶向引导分子或编码所述DNA靶向引导分子的第二核酸，其中所述DNA靶向引导分子和所述核酸酶形成多单元或单分子基因组编辑系统；以及c)能够拴系所述基因组编辑系统的两个实体的系链分子，或编码所述系链分子的第三核酸，其中所述系链分子是基于寡核苷酸的分子或与核酸酶异源的交联剂。
[0007]在另一个方面，本申请提供了一种基因组编辑系统，其包括：a)两个或更多个位点特异性核酸酶或编码所述两个或更多个位点特异性核酸酶的第一核酸；以及b)系链分子或编码所述系链分子的第二核酸，其中所述系链分子能够将结合于对应靶位点的两个或更多个位点特异性核酸酶拴系在一起，并且其中所述系链分子是基于寡核苷酸的分子或与核酸酶异源的交联剂。
[0008]在一个方面，本申请提供了第一基因组编辑系统，其包括：a)CRISPR相关(Cas)核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其中所述Cas核酸酶与能够连接所述Cas核酸酶的两个分子的交联剂偶联；以及b)第一和第二引导RNA(gRNA)或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，并且其中所述第一和第二gRNA中的每一个都能够与Cas核酸酶形成复合物。
[0009]在一个方面，本申请提供了第二基因组编辑系统，其包括：a)CRISPR相关(Cas)核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其中所述Cas核酸酶与能够连接所述Cas核酸酶的两个分子的交联剂偶联；b)第一和第二引导RNA(gRNA)或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，并且其中所述第一和第二gRNA中的每一个能够与Cas核酸酶形成复合物；以及c)对应于所述第一
gRNA的第一系链引导寡核苷酸(tgOligo)和对应于所述第二gRNA的第二tgOligo，其中所述第一和第二tgOligo能够彼此杂交。
[0010]在一个方面，本申请提供了第三基因组编辑系统，其包括：a)CRISPR相关(Cas)核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其中所述Cas核酸酶与能够连接所述Cas核酸酶的两个分子的交联剂偶联；b)第一和第二引导RNA(gRNA)或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，并且其中所述第一和第二gRNA中的每一个能够与Cas核酸酶形成复合物；c)被第三和第四gRNA靶序列侧接的模板分子；以及d)对应于所述第一gRNA的第一tgOligo、对应于所述第二gRNA的第二tgOligo、对应于所述第三gRNA的第三tgOligo和对应于所述第四gRNA的第四tgOligo，其中所述第一和第三tgOligo能够彼此杂交，并且其中所述第二和第四tgOligo能够彼此杂交。
[0011]在一个方面，本申请提供了第四基因组编辑系统，其包括：a)CRISPR相关(Cas)核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其中所述Cas核酸酶与能够连接所述Cas核酸酶的两个分子的交联剂偶联；b)第一和第二引导RNA(gRNA)或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，并且其中所述第一和第二gRNA中的每一个能够与Cas核酸酶形成复合物；c)与交联剂偶联的失活Cas(dCas)核酸酶，或编码所述dCas核酸酶和交联剂的核酸；以及d)第三和第四gRNA或编码第三和第四gRNA的一个或多个核酸，其中所述第三和第四gRNA的靶序列在靶基因组区段的内部和相反端上，并且其中结合于所述第三或第四gRNA靶序列的dCas核酸酶能够与结合于靶基因组区段另一端的gRNA靶序列的Cas核酸酶二聚化。
[0012]在一个方面，本申请提供了第五基因组编辑系统，其包括：a)CRISPR相关(Cas)核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其中所述Cas核酸酶与能够连接所述Cas核酸酶的两个分子的交联剂偶联；b)第一和第二引导RNA(gRNA)或编码第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，并且其中第一和第二gRNA中的每一个能够与Cas核酸酶形成复合物；以及c)被两个gRNA靶序列侧接的模板分子，其中所述模板分子的每一端包含与侧接靶基因组区段的序列同源的序列。
[0013]在一个方面，本申请提供了第六基因组编辑系统，其包括：a)CRISPR相关(Cas)核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其中所述Cas核酸酶与能够连接所述Cas核酸酶的两个分子的交联剂偶联；b)第一和第二引导RNA(gRNA)或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，并且其中所述第一和第二gRNA中的每一个能够与Cas核酸酶形成复合物；以及c)被两个gRNA靶序列侧接的模板分子，其中所述模板分子的每一端包含与侧接靶基因组区段的序列同源的序列；以及d)失活Cas(dCas)核酸酶或编码所述dCas核酸酶的核酸，其中所述dCas核酸酶与交联剂偶联并且能够与所述模板分子上的两个gRNA靶序列结合。
[0014]在一个方面，本申请提供了第七基因组编辑系统，其包括：a)Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸；b)第一和第二gRNA或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段；以及c)对应于所述第一gRNA的第一tgOligo和对应于所述第二gRNA的第二tgOligo，其中所述第一和第二tgOligo能够彼此杂交。
[0015]在一个方面，本申请提供了第八基因组编辑系统，其包括：a)Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种基因组编辑系统，其包括：(a)核酸酶或编码所述核酸酶的第一核酸；(b)DNA靶向引导分子或编码所述DNA靶向引导分子的第二核酸，其中所述DNA靶向引导分子和所述核酸酶形成多单元或单分子基因组编辑系统；(c)能够将所述基因组编辑系统的两个实体栓系在一起的系链分子，或编码所述系链分子的第三核酸，其中所述系链分子是基于寡核苷酸的分子或与所述核酸酶异源的交联剂。2.如权利要求1所述的基因组编辑系统，其中所述核酸酶是FokI核酸酶或RNA引导的核酸酶。3.如权利要求1所述的基因组编辑系统，其中所述核酸酶是选自由以下组成的组的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸酶(Cas核酸酶)：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1(也称为Cas12a)及其同源物或修饰型式。4.如权利要求1所述的基因组编辑系统，其中DNA靶向引导分子是RNA。5.如权利要求1所述的基因组编辑系统，其中DNA靶向引导分子选自由CRISPR引导RNA、TAL效应结构域和锌指结构域组成的组。6.如权利要求1所述的基因组编辑系统，其中所述系链分子选自由tgOligo、交联剂和二聚化结构域组成的组。7.一种基因组编辑系统，其包括：(a)CRISPR相关(Cas)核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸，其中所述Cas核酸酶与能够连接所述Cas核酸酶的两个分子的交联剂偶联；以及(b)第一和第二引导RNA(gRNA)或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，并且其中所述第一和第二gRNA中的每一个都能够与所述Cas核酸酶形成复合物。8.如权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述交联剂包含选自由以下组成的组的结构域：同源二聚化结构域、异源二聚化结构域、诱导型二聚化结构域、单链DNA结合结构域和RNA结合结构域。9.如权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述交联剂需要交联配体。10.如权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述系统还包括(c)对应于所述第一gRNA的第一系链引导寡核苷酸(tgOligo)和对应于所述第二gRNA的第二tgOligo。11.如权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述系统还包括:(c)被第三和第四gRNA靶序列侧接的模板分子；以及(d)对应于所述第一gRNA的第一tgOligo、对应于所述第二gRNA的第二tgOligo、对应于所述第三gRNA的第三tgOligo和对应于所述第四gRNA的第四tgOligo，其中所述第一和第三tgOligo能够彼此杂交，并且其中所述第二和第四tgOligo能够彼此杂交。
12.如权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述系统还包括：(c)与交联剂偶联的失活Cas(dCas)核酸酶，或编码所述dCas核酸酶和交联剂的核酸；(d)第三和第四gRNA或编码所述第三和第四gRNA的一个或多个核酸，其中所述第三和第四gRNA的靶序列在所述靶基因组区段的内部和相反端上，并且其中结合于所述第三或第四gRNA靶序列的dCas核酸酶能够与结合于所述靶基因组区段另一端的gRNA靶序列的Cas核酸酶二聚化。13.如权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述系统还包括：(c)被两个gRNA靶序列侧接的模板分子，其中所述模板分子的每一端包含与侧接所述靶基因组区段的序列同源的序列。14.如权利要求13所述的基因组编辑系统，其中所述系统还包括：(d)对应于多个靶基因组区段的多个模板分子。15.如权利要求7所述的基因组编辑系统，其中所述系统还包括：(c)被两个gRNA靶序列侧接的模板分子，其中所述模板分子的每一端包含与侧接所述靶基因组区段的序列同源的序列；以及(d)失活Cas(dCas)核酸酶或编码所述dCas核酸酶的核酸，其中所述dCas核酸酶与交联剂偶联并且能够与所述模板分子上的所述两个gRNA靶序列结合。16.一种基因组编辑系统，其包括：(a)Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸；(b)第一和第二gRNA或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段；以及(c)对应于所述第一gRNA的第一tgOligo和对应于所述第二gRNA的第二tgOligo，其中所述第一和第二tgOligo能够彼此杂交。17.如权利要求16所述的基因组编辑系统，其中所述Cas核酸酶与交联剂偶联，并且其中所述系统还包括：(d)与交联剂偶联的失活Cas(dCas)核酸酶，或编码所述dCas核酸酶和交联剂的一个或多个核酸；(e)第三和第四gRNA或编码所述第三和第四gRNA的一个或多个核酸，其中所述第三和第四gRNA的靶序列在所述靶基因组区段的内部和相反端上；并且其中结合于所述第三或第四gRNA靶序列的dCas核酸酶能够与结合于所述靶基因组区段的另一端的gRNA靶序列的Cas核酸酶二聚化。18.一种基因组编辑系统，其包括：(a)Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸；(b)第一和第二gRNA或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段，(c)对应于所述第一gRNA并且进一步能够在所述第一gRNA靶位点的另一端与所述靶基因组区段杂交的第一tgOligo，以及(d)对应于所述第二gRNA并且进一步能够在所述第二gRNA靶位点的另一端与所述靶基因组区段杂交的第二tgOligo。
19.一种基因组编辑系统，其包括：(a)Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的核酸；(b)第一和第二gRNA或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，其中所述第一gRNA的靶序列和所述第二gRNA的靶序列侧接靶基因组区段；(c)对应于所述第一gRNA的第一tgOligo和对应于所述第二gRNA的第二tgOligo；(d)一个或多个具有两个突出端的双链寡核苷酸(dsOligo)，其中所述两个突出端中的每一个都能够与所述第一或第二tgOligo杂交。20.一种用于染色体工程的方法，其包括将基因组编辑系统引入靶细胞，所述系统包括：(a)与交联剂偶联的Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶和交联剂的一个或多个核酸，其中所述交联剂能够连接两个Cas核酸酶分子；以及(b)第一和第二gRNA或编码所述第一和第二gRNA的一个或多个核酸，并且其中所述第一和第二gRNA在一对供体和受体染色体上的所关注的第一重组区域中具有靶序列；以及产生包含所述供体染色体的一部分和所述受体染色体的一部分的重组染色体。21.如权利要求20所述的方法，其中所述交联剂包含选自由以下组成的组的结构域：同源二聚化结构域、异源二聚化结构域...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：