一种组合物及其试剂盒与纯化方法技术

一种组合物及其试剂盒与纯化方法，组合物包含磁珠以及聚乙二醇。该组合物可用于纯化经过酸性还原试剂还原后的核酸分子，聚乙二醇的加入，可以显著提升核酸的还原回收率，而且使得回收率更稳定。该组合物作为纯化体系，可以更方便地匹配自动化仪器，提升样本通量，纯化回收的产物不影响后续文库扩增以及修饰碱基的检测过程，并有效降低试剂成本，无需高速离心机等特殊设备。心机等特殊设备。心机等特殊设备。

【技术实现步骤摘要】
一种组合物及其试剂盒与纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种组合物及其试剂盒与纯化方法。

技术介绍

[0002]早在1925年，在DNA双螺旋结构鉴定之前，DNA甲基化修饰就已经被发现。DNA甲基化修饰最主要的形式是5mC及其衍生修饰，被认为是DNA的“第五种碱基”。DNA甲基化在基因调控、遗传印迹、衰老、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥着重要作用。最近研究表明，cell
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free DNA(以下简称cfDNA)甲基化特征是肿瘤早期筛查的重要标志物。
[0003]重亚硫酸盐可将胞嘧啶(C)脱氨基转化为尿嘧啶(U)，在随后的PCR过程中，采用U 耐受的聚合酶，将U识别为胸腺嘧啶(T)，实现C到T的转化，从而达到将未修饰C和甲基化修饰C分开的目的。全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing， WGBS)将未甲基化的胞嘧啶转化为胸腺嘧啶(约95％的C会被转化为T)，可覆盖全基因组 70～99％的胞嘧啶，实现全基因组水平单碱基分辨率甲基化检测。全基因组重亚硫酸盐测序也是甲基化检测的一个“金标准”。但是重亚硫酸盐处理会使DNA大量降解，需要较高的D NA投入量，对于DNA含量较少的样本不友善，例如血浆游离DNA。另外，重亚硫酸盐是将未甲基化的胞嘧啶转化成T，而未甲基化的胞嘧啶占基因组所有胞嘧啶的95％以上，因此，使用重亚硫酸盐处理后构建的二代测序文库，碱基平衡性差(AT占比>80％)，测序时需要添加15％的噬菌体PhiX DNA平衡，造成测序数据大量浪费。最后，WGBS产生的数据测序质量差，而且比对到基因组时需要使用特殊的软件(例如Bismark)，比对率较差，通常只有70％左右，进一步造成数据的浪费。
[0004]公开号为CN 110820050 A的中国专利《全基因组甲基化非重亚硫酸氢盐测序文库及构建》表明，在一定条件下，甲基化C可以被10
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11转位酶(TET酶)转为羧基化C，通过有机硼烷(例如吡啶硼烷)可以将羧基化的C转化成二氢尿嘧啶，经过测序，可以识别为T，进而区分甲基化C与未甲基化C。基于此原理专利技术的全基因组甲基化非亚硫酸盐文库构建技术，有效解决了文库复杂度低和测序数据深度低的缺陷，同时可实现在多种二代测序平台的甲基化检测。
[0005]使用此非亚硫酸盐方法构建的文库，不仅能在全基因组水平检测甲基化，而且能同时检测碱基突变，具有检测基因组多种特征的能力，因此具有重要的临床引用价值。近来研究发现，血浆cfDNA甲基化、突变和片段特征在肿瘤早期筛查方面具有重要的价值。但血浆cfDNA是不同组织释放的，而且绝大多数cfDNA来源于正常血细胞，对于早期癌症患者来说，肿瘤组织释放的循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)在血浆中占比极低，因此，在构建cfDNA二代测序文库过程中，需要最大限度减少DNA模板损失，提升ctDNA各特征检测的灵敏度。
[0006]现有的非重亚硫酸盐测序过程中，吡啶硼烷还原后的产物由于含有高浓度的NaAC(约600mM)和吡啶硼烷(约1M)，再加上较低的pH(约4.3)，NGS磁珠在常规纯化操作条件下不能回收还原后DNA。现有技术采用商业化的离心柱纯化方法纯化还原后DNA，例如 zymo公司
的IC
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Spin柱、Bio
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rad公司的Micro Bio
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Spin 6柱，回收率中位仅45％左右，且非常不稳定，范围宽至30～70％，波动很大。另外，柱法纯化需要高速离心设备，样本通量被离心机通量所限制，当样本量较大时，无法匹配自动化仪器，非常耗时耗力。

技术实现思路

[0007]根据第一方面，在一实施例中，提供一种组合物，包含磁珠以及聚乙二醇。
[0008]根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述组合物和/或用于制备所述组合物的组分。
[0009]根据第三方面，在一实施例中，提供一种纯化方法，包括：将核酸分子与第一方面所述组合物混合，然后回收核酸分子，得到纯化后的核酸分子。
[0010]依据上述实施例的组合物及其试剂盒与纯化方法，该组合物可用于纯化经过酸性还原试剂还原后的核酸分子，聚乙二醇的加入，可以显著提升核酸的还原回收率，而且使得回收率更稳定。
[0011]在一实施例中，该组合物作为纯化体系，可以更方便地匹配自动化仪器，提升样本通量，纯化回收的产物不影响后续文库扩增以及修饰碱基的检测过程，并有效降低试剂成本，无需高速离心机等特殊设备。
附图说明
[0012]图1为常规磁珠纯化、柱纯化、增强型磁珠纯化还原后产物回收率评估结果图。
[0013]图2为柱纯化和增强型磁珠纯化还原后产物扩增效率评估图。
[0014]图3为柱纯化和增强型磁珠纯化还原后产物转化率评估。
具体实施方式
[0015]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0016]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0017]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
[0018]为了提升还原后纯化回收率，同时使回收率更稳定，且可匹配自动化纯化仪器，在一实施例中，本专利技术提供了一种磁珠纯化的缓冲液和纯化流程(命名为“增强型磁珠纯
化”)，能显著提升还原后回收率并保持稳定，纯化步骤不需要高速离心机等设备，操作简单，与柱纯化相比成本低廉，同时本方法回收的还原产物不影响后续PCR扩增效率和5mC到T的转化率。由于本方法是基于磁珠法原理，因此很容易转换为自动化流程，适配自动化仪器，从而极大地提升样本通量，减少人力成本。
[0019]根据第一方面，在一实施例中，提供一种组合物，包含磁珠以及聚乙二醇(简称PEG)。该组合物可用于纯化经过有机硼烷还原后的核酸分子，聚乙二醇的加入，可以显著提升核酸的还原回收率，而且本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于，包含磁珠以及聚乙二醇。2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述磁珠为干粉状或悬浮液；和/或，所述磁珠为悬浮液时，所述磁珠的体积与聚乙二醇的质量之比为1:(0.25～0.75)。3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含磁珠以及聚乙二醇水溶液，所述磁珠为悬浮液时，所述磁珠与聚乙二醇水溶液的体积比为1：(0.5～1.5)；和/或，所述聚乙二醇水溶液中聚乙二醇的质量体积百分比为50％。4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为200～20000。5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述磁珠用于纯化核酸分子；所述核酸分子包含DNA、RNA中的至少一种；所述核酸分子来源于组织样本、体液样本中的至少一种；所述核酸分子包含来源于体液样本的cfDNA。6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物用于纯化经过还原试剂处理后的核酸分子；和/或，所述还原试剂的pH＜7；和/或，所述还原试剂的pH为4.0～4.5，优选为4.3；和/或，所述还原试剂包含有机硼烷以及有机酸盐；和/或，所述有机硼烷用于将核酸分子中氧化的5
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甲基胞嘧啶(5mC)残基转化为二氢尿嘧啶(DHU)残基；和/或，氧化的5
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甲基胞嘧啶残基包含5
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羧基胞嘧啶(5caC)残基、5
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醛基胞嘧啶(5fC)残基中的至少一种；和/或，所述有机硼烷包括硼烷与选自氮杂环和叔胺的含氮化合物的络合物；和/或，所述有机硼烷包含硼烷和氮杂环的络合物；和/或，所述氮杂环包含任选经1～4个低级烷基取代的吡啶；和/或，所述氮杂环包含吡啶、2
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甲基吡啶或5
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乙基
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甲基吡啶；和/或，所述有机硼烷包括吡啶硼烷、2
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甲基吡啶硼烷中的至少一种；和/或，所述有机酸盐包含醋酸钠。7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～6任意一项所述组合物和/或用于制备所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴炜，刘佳慧，赵美茹，沈璐，钟文星，易鑫，伍佳豪，
申请(专利权)人：深圳吉因加医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：