芒果象甲DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种芒果象甲DNA提取方法，包括：步骤一、液氮研磨：选取芒果象甲虫体，去除所述芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织；根据所述胸脯肌肉组织的大小选取容积相匹配的研磨容器；在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品；步骤二、裂解消化：在DNA裂解液中加入蛋白酶K，对所述粉末状样品进行裂解消化；步骤三、醇沉：利用无水乙醇对经过裂解消化处理的样品进行处理；步骤四、洗脱：对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集DNA；步骤五、清除RNA：向所收集的DNA中加入RNaseA，清除RNA。本发明专利技术对传统提取方法进行改良，可获得高纯度、高质量的芒果象甲DNA。量的芒果象甲DNA。量的芒果象甲DNA。

【技术实现步骤摘要】
芒果象甲DNA提取方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种芒果象甲DNA提取方法。

技术介绍

[0002]芒果(Mangifera indica L.)系漆树科芒果属常绿乔木，享有“热带水果之王”的美誉。芒果象甲为鞘翅目象甲科害虫，分为芒果切叶象甲、芒果果肉象甲、芒果果实象甲和芒果果核象甲四大类，前者主要为害嫩叶，后三者被我国列入二类危险性害虫名单，是植物检疫的重点对象，主要为害果实、果肉，给芒果产业造成极大地损失。
[0003]当前对芒果象甲的研究大多停留在形态观察和生物学习性观测方面，对芒果象甲的分子鉴定、分子抗性机理等分子生物学研究处于初级探索阶段，因此为了克服传统形态学研究的不确定性和局限性，迫切需要进一步开展芒果象甲分子生物学研究，以便快速准确识别不同类型的芒果象甲，了解芒果象甲的抗性机制，而后对症下药。
[0004]DNA提取是开展芒果象甲分子生物学研究的重要环节，当前多采用经典的酚氯仿方法提取昆虫DNA。实验结果表明，该方法用于提取芒果象甲DNA时存在提取率低，含有较多蛋白质、酚类物质等问题，影响后续的PCR扩增，易导致实验失败，因此迫切需要探索出一种快速高效的芒果象甲DNA提取方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
[0006]本专利技术的一个目的是提供一种芒果象甲DNA提取方法，其可以提高对芒果象甲DNA的提取纯度和质量。
[0007]为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种芒果象甲DNA提取方法，包括：
[0008]步骤一、液氮研磨：选取芒果象甲虫体，去除所述芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织；根据所述胸脯肌肉组织的大小选取容积相匹配的研磨容器；在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品；
[0009]步骤二、裂解消化：在DNA裂解液中加入蛋白酶K，对所述粉末状样品进行裂解消化；
[0010]步骤三、醇沉：利用无水乙醇对经过裂解消化处理的样品进行处理；
[0011]步骤四、洗脱：对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集DNA；
[0012]步骤五、清除RNA：向所收集的DNA中加入RNaseA，清除RNA。
[0013]优选的是，所述的芒果象甲DNA提取方法中，所述步骤一中，所述所选取的研磨容器为2mL离心管或中号规格的研钵。
[0014]优选的是，所述的芒果象甲DNA提取方法中，所述步骤二中，所述在DNA裂解液中加入蛋白酶K，对所述粉末状样品进行裂解消化，其具体过程包括：
[0015]步骤(1)加DNA裂解液A消化：向所述粉末状样品中加入180μL DNA裂解液A以及20μL蛋白酶K，充分混匀；其中，所述DNA裂解液A为基因组DNA小量抽提试剂盒中的成分；
[0016]步骤(2)水浴：在55℃条件下水浴孵育1～3h至完全裂解，中间每隔15min轻微摇匀一次；
[0017]步骤(3)加DNA裂解液B消化：加入200μL DNA裂解液B，充分混匀，在70℃条件下水浴10min，其中，所述DNA裂解液B为所述基因组DNA小量抽提试剂盒中的成分。
[0018]优选的是，所述的芒果象甲DNA提取方法中，所述步骤四中，所述对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集DNA，其具体过程包括：
[0019]步骤(1)第一次洗脱：将所述经过醇沉处理的样品加入到DNA纯化柱，使沉淀全部转移，12000rmp离心1min，弃废液，加入500μL洗涤液I，12000rmp离心1min，弃废液；
[0020]步骤(2)第二次洗脱：加入600μL洗涤液II，12000rmp离心1min，倒废液，12000rmp离心1min；
[0021]步骤(3)收集DNA：将所述DNA纯化柱置于1.5mL离心管上，加入100μL的洗脱液，室温放置3min，12000rmp离心1min，所得液体即为纯化的DNA；其中，所述洗涤液I、所述洗涤液II和所述洗脱液均为所述基因组DNA小量抽提试剂盒中的成分。
[0022]优选的是，所述的芒果象甲DNA提取方法中，所述步骤五中，向所收集的DNA中加入2μL 100mg/ml RNaseA，混匀，室温下放置2min。
[0023]优选的是，所述的芒果象甲DNA提取方法中，所述步骤一中，所选取的芒果象甲虫体为由纯酒精浸泡的虫体；所述去除芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织之后，将所述胸脯肌肉组织用无菌水进行冲洗，去除残余的酒精。
[0024]优选的是，所述的芒果象甲DNA提取方法中，所述步骤(2)中，在水浴过程中，在两次轻微摇匀的中间进行超声处理，其中，超声功率为80w，超声1s；所述步骤(3)中，在DNA裂解液B消化过程中，进行超声处理，其中，超声功率为60w，超声1s，停歇2min，循环至水浴结束。
[0025]优选的是，所述的芒果象甲DNA提取方法中，所述步骤一中，所述在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品，其具体过程包括：
[0026]步骤(1)向所述所选取的研磨容器中加入液氮，利用液氮对所选取的研磨容器和研磨棒进行预冷却；
[0027]步骤(2)将所述胸脯肌肉组织放入所述所选取的研磨容器中，快速研磨，每研磨20s向所述所选取的研磨容器中补充液氮，直至将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到所述粉末状样品。
[0028]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0029](1)根据虫体大小选用容积相匹配的研磨容器进行液氮研磨，可使研磨更精细、更充分，提高DNA释放量。
[0030](2)去掉芒果象甲成虫的鞘翅，选取胸脯肌肉组织，可提高研磨质量。
[0031](3)DNA裂解液中加入蛋白酶K，可以消除蛋白质对DNA的干扰，从而提高提取纯度和质量。
[0032](4)本专利技术所提供的方法对传统提取方法进行改良，可获得高纯度、高质量的芒果象甲DNA，为保证芒果象甲分子生物学研究顺利开展奠定基础。
[0033]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0034]图1为本专利技术一个实施例所述的芒果象甲DNA提取方法的示意图；
[0035]图2为本专利技术实施例1所述的2只芒果象甲DNA的凝胶电泳检测图；
[0036]图3为本专利技术实施例2所述的2只芒果象甲DNA的凝胶电泳检测图。
具体实施方式
[0037]下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0038]如图1所示，本专利技术提供了一种芒果象甲DNA提取方法，包括：
[0039]步骤一、液氮研磨：选取芒果象甲虫体，去除所述芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织；根据所述胸脯肌肉组织的大小选取容积相匹配的研磨容器；在所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种芒果象甲DNA提取方法，其特征在于，包括：步骤一、液氮研磨：选取芒果象甲虫体，去除所述芒果象甲虫体的鞘翅，选取胸脯肌肉组织；根据所述胸脯肌肉组织的大小选取容积相匹配的研磨容器；在所选取的研磨容器内利用液氮将所述胸脯肌肉组织研磨至粉末状，得到粉末状样品；步骤二、裂解消化：在DNA裂解液中加入蛋白酶K，对所述粉末状样品进行裂解消化；步骤三、醇沉：利用无水乙醇对经过裂解消化处理的样品进行处理；步骤四、洗脱：对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集DNA；步骤五、清除RNA：向所收集的DNA中加入RNaseA，清除RNA。2.如权利要求1所述的芒果象甲DNA提取方法，其特征在于，所述步骤一中，所述所选取的研磨容器为2mL离心管或中号规格的研钵。3.如权利要求1所述的芒果象甲DNA提取方法，其特征在于，所述步骤二中，所述在DNA裂解液中加入蛋白酶K，对所述粉末状样品进行裂解消化，其具体过程包括：步骤(1)加DNA裂解液A消化：向所述粉末状样品中加入180μL DNA裂解液A以及20μL蛋白酶K，充分混匀；其中，所述DNA裂解液A为基因组DNA小量抽提试剂盒中的成分；步骤(2)水浴：在55℃条件下水浴孵育1～3h至完全裂解，中间每隔15min轻微摇匀一次；步骤(3)加DNA裂解液B消化：加入200μL DNA裂解液B，充分混匀，在70℃条件下水浴10min，其中，所述DNA裂解液B为所述基因组DNA小量抽提试剂盒中的成分。4.如权利要求1所述的芒果象甲DNA提取方法，其特征在于，所述步骤四中，所述对经过醇沉处理的样品进行洗脱处理，收集DNA，其具体过程包括：步骤(1)第一次洗脱：将所述经过醇沉处理的样品加入到DNA纯化柱，使沉淀全部转移，12000rmp离心1min，弃废液，加入500μL洗涤液I，...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨翠凤，滕峥，苏仕林，黄团，欧阳秋飞，
申请(专利权)人：百色学院，
类型：发明
国别省市：